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5-羥色胺ELISA Kit使用說明書

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深圳市科潤達生物工程有限公司
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5-羥色胺ELISA Kit使用說明書

（德國IBL:RE59121）

1、 應(yīng)用范圍

此試劑盒可用于人血清、血漿、血小板和尿液中五羥色胺的體外定量檢測。進一步的研究表明：此試劑盒還可用于組織勻漿和細胞培養(yǎng)上清液的研究。

2、前言說明

五羥色胺是色氨酸代謝的中間產(chǎn)物，它主要存在于腸嗜鉻細胞、血清素激活的神經(jīng)元和血小板中，它已被確定為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種神經(jīng)遞質(zhì)。循環(huán)血液中的五羥色胺幾乎都集中于血小板內(nèi)。循環(huán)五羥色胺濃度的變化可反映出人體的一些病理變化，這些病理變化包括：慢性肌緊張性頭痛、精神分裂癥、高血壓、舞蹈癥、杜氏肌肉萎縮癥和早期急性闌尾炎。血清五羥色胺的檢測對類癌綜合征的檢測具有重要臨床意義。人們預(yù)計：在不久的將來，人們對血小板內(nèi)五羥色胺的研究興趣（包括五羥胺的吸收及釋放動力學研究）應(yīng)該會不斷增長。

3、實驗原理

樣品準備（將五羥色胺轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>N-乙酰五羥色胺）是樣品的稀釋的一部分，將每一份樣品分別于酰化試劑一起溫育就可以得到酰化的五羥色胺。此實驗采用的是競爭性ELISA的原理，生物素標記的和非生物素標記的抗原競爭性結(jié)合到一定數(shù)量的抗體結(jié)合位點上。zui后，結(jié)合到抗體上的生物素標記抗原的量于樣品中被分析物的濃度成反比。當反應(yīng)系統(tǒng)達到平衡后，洗板除去未結(jié)合的生物素標記抗原，用抗生物素堿性磷酸酶做標記、對硝基苯磷酸做底物來檢測結(jié)合到抗體上的生物素標記抗原的量。用已知標準品做一條標準曲線，將未知樣品的酶活性在標準曲線上進行定標就可以得到未知樣品中五羥色胺的濃度。

4、貯存與穩(wěn)定性

試劑盒和運輸環(huán)境和儲存環(huán)境溫度為2-8℃，避免熱源或太陽直射。樣品的儲存與穩(wěn)定性及試劑的準備將在相關(guān)章節(jié)中闡述。打開了的試劑盒在有效期內(nèi)穩(wěn)定，前提是要將試劑盒用袋子密封并儲存于2-8℃的環(huán)境下。

5、樣品的采集與儲存

注意	有些食物會含有一定量的五羥色胺，另外，有些藥物也會刺激五羥色胺的釋放，從而導致五羥色胺的濃度升高。病人應(yīng)當禁食富含五羥色胺的食物，如：阿司匹林、促腎上腺皮質(zhì)激素、MAO抑制劑、phenazetin、兒茶酚氨、利血平和煙堿。

血清

注意靜脈穿刺采集全血的常規(guī)注意事項。從采集到血液樣品的那一刻起到檢測時都應(yīng)保持血液樣品的化學整體性。不要使用明顯溶血、黃疸血和脂血樣品。如果樣品出現(xiàn)混濁，則在實驗前應(yīng)當離心以除去所有的微粒物質(zhì)。
貯存	18-25℃	2-8℃	≤-20℃	避免熱源或太陽直射，避免反復凍融，冷凍狀態(tài)下運輸樣品。
穩(wěn)定性	2小時	6小時	3個月	避免熱源或太陽直射，避免反復凍融，冷凍狀態(tài)下運輸樣品。

尿液

可以是自然尿液也可使用24h尿液。收集病人24h內(nèi)的所有尿液，之后將其加入到10-15ml 6N的HCl防腐劑中。確定用于結(jié)果結(jié)算的總體積。使用前請將所有樣品混合并離心。
貯存	≤-20℃	避免熱源或太陽直射，避免反復凍融。
穩(wěn)定性	6個月

血漿、血小板

98%以上的循環(huán)五羥色胺都位于血小板內(nèi)，在血液凝集時就可以釋放出來。用靜脈穿刺的方法將全血收集到含EDTA或檸檬酸的塑料試管中（如10mlMonovette NC試管中加入1ml檸檬酸溶液）。室溫下，將全血樣品以200×g的速率離心10分鐘得到富含血小板的血漿（PRP）。將PRP-上清轉(zhuǎn)移到另一試管中。為了獲得血小板乳糜微粒，我們將200ulPRP（350000～500000個血小板/ul）加入到800ul生理鹽水中，之后4℃下以4500×g的速率離心10分鐘（或4℃下10000×g的速率離心2分鐘）。離心后棄取上清。在血小板乳糜微粒中加入200ul雙蒸水，之后樣品就可以在-20℃以下的環(huán)境下凍存數(shù)周了。將凍融的樣品在室溫下以1000×g的速率離心2分鐘。整個實驗需要使用20ul上清液（見酰化）。如果您想測無血小板血漿（PFP）中五羥色胺的濃度，我們可以將PRP在4℃以4500×g的速率離心10分鐘（或4℃下10000×g的速率離心2分鐘）就可以獲得無血小板血漿（PFP）。游離五羥色胺的ELISA實驗要使用50ul上清液（見酰化）。注意：PRP中五羥色胺的直接檢測實驗表明：大約10%的PRP樣品可以檢測到不可預(yù)知的高濃度五羥色胺（結(jié)果用液相層析和流氏細胞術(shù)獲得）。為了避免這種差異性，我們建議您即檢測血小板中五羥色胺，也檢測無血小板血漿中的五羥色胺。
	無血小板血漿	血小板微粒（從血漿中分離得到）		避免熱源或太陽直射，避免反復凍融，冷凍狀態(tài)下運輸樣品。
儲存	≤-20℃	≤-20℃	≤-80℃
穩(wěn)定性	2周	4周	1年

組織勻漿和細胞培養(yǎng)上清

使用組織勻漿和細胞培養(yǎng)上清作樣品，一般無特殊注意事項

注意：細胞培養(yǎng)基可能含有一定量的五羥色胺！

儲存

≤-20℃

避免熱源或太陽直射，避免反復凍融。

穩(wěn)定性

6個月

6、試劑盒成分

注意	試劑盒有足夠做96份單孔檢測或48份雙孔檢測所需的試劑成分。

數(shù)量	標記	成分
1×12×8	MTP	包被板，可拆，微孔中包被了羊抗兔抗血清。
1×5ml	ANTISERUM	組胺抗血清，藍色，即用，內(nèi)含：兔抗血清、Tris緩沖液和0.01%的NaN₃。
1×5ml	BIOTIN	五羥色胺生物素，黃色，即用，內(nèi)含0.1%的NaN₃。
1×0.2ml	ENZCONJ CONC	酶聯(lián)物，10倍濃縮，內(nèi)含堿性磷酸酶標記的抗生物素抗體、Tris緩沖液、HCl和0.01%的NaN₃。
1×7×0.5ml	CAL A-G	標準品A-G，0;0.08;0.24;0.73;2.2;6.6;19.8ng/ml,0;0.45;1.4; 4.1;12.5;37.4;112.3nmol/l,即用，內(nèi)含酰化的五羥色胺、磷酸鹽緩沖液和0.1%的NaN₃。
1×2×0.5ml	CONTROL 1+2 LYO	質(zhì)控品1+2，凍干，內(nèi)含人血清和0.02%的NaN₃。具體濃度及可允許范圍請見試劑瓶標簽。
1×3ml	ACYLREAG	酰化試劑內(nèi)含乙酸酐和丙酮，即用
1×50ml	ASSAYBUF CONC	檢測緩沖液，10倍濃縮，內(nèi)含磷酸緩沖液、BSA和1%的NaN³。
1×50ml	WASHBUF CONC	洗滌液，20倍濃縮，內(nèi)含磷酸緩沖液、吐溫和0.1%的硫柳汞。
1×9×	PNPP SUBS	PNPP底物片，密封于鋁鉑金屬袋內(nèi)，內(nèi)含對硝基苯酚磷酸鹽。
1×27ml	PNPP BUF	PNPP底物緩沖液，即用，內(nèi)含二乙醇胺、水和0.05%的NaN₃。
1×15ml	PNPP STOP	PNPP終止液，即用，內(nèi)含1M的NaOH和0.25M的EDTA。
3×	FOIL	粘性金屬板

7、實驗所需器材但試劑盒不提供

1）移液器，體積：20;25;50;100;1000ul

2）玻璃試管（12×75mm）

3）試管架

4）振蕩器（500rpm）

5）旋渦混合器

6）水浴箱，37℃

7）帶儲器的8道移液器

8）洗滌瓶，自動或半自動洗板機

9）離心機：≥1500×g

10）可在405nm處讀數(shù)的酶標儀（參考波長：600-650nm）

11）雙蒸水或去離子水

12）吸水紙、取樣吸頭和計時器

8、實驗前的準備說明

供手動和自動操作參考用

注意	用于96孔檢測的試劑成分可分成3次用。下述體積是使用4條（32孔）時所需要的體積。如果客戶想將標準品從7支減為6支的話，我們可以省掉標準品G。則檢測范圍相應(yīng)的減少到155ug/l（血漿）或706ug/l（血清，尿液，組織勻漿和細胞培養(yǎng)上清）。血清、尿液、組織勻漿和細胞培養(yǎng)上清樣品可以選擇簡短操作步驟進行，只需溫育3.5個小時（但血漿樣品不能采用簡短操作步驟進行），以上樣品也可以選擇可選操作步驟進行檢測（將樣品溫育一整夜），血漿樣品必須按照溫育一整夜進行檢測。

8.1凍干或濃縮成分的準備

稀釋/溶解	成分	加入	稀釋劑	比例	備注	儲存	穩(wěn)定性
15ml	檢測緩沖液	150ml	雙蒸水	1：10	出現(xiàn)黃褐色并不會影響實驗結(jié)果	2-8℃	2周
15ml	洗滌液	300ml	雙蒸水	1：20		2-8℃	4周
	質(zhì)控品	0.5ml	雙蒸水		靜置15min,混合時無泡沫	≤-20℃	有效期內(nèi)穩(wěn)定
60ul	酶聯(lián)物	6ml	稀釋的檢測緩沖液	1:101	臨時配置,只能使用一次	18-25℃	2小時
3	PNPP底物片	8ml	PNPP底物緩沖液		臨時配置，只能使用一次	18-25℃	5小時

8.2樣品的稀釋

樣品五羥色胺濃度高于zui高標準品的必須用檢測緩沖液進行進一步的稀釋。

8.3樣品和質(zhì)控品的酰化

樣品A：血清，尿液，血小板提取物，組織勻漿和質(zhì)控品

樣品B：無血小板血漿

注意	請不要酰化標準品，標準品已經(jīng)酰化了。樣品準備可使血清、尿液、血小板乳糜微粒、組織勻漿和細胞培養(yǎng)上清被稀釋107倍，而血漿樣品則被稀釋23.5倍。結(jié)果計算時必須將此稀釋因子考慮進去。

8.3.1樣品A：血清、尿液、血小板提取物、組織勻漿和質(zhì)控品

1	將質(zhì)控品和樣品A分別20ul加入到玻璃試管中。
2	在每一試管中加入100ul稀釋好的檢測緩沖液，旋渦混合。
3	在每一試管中加入25ul酰化試劑1（3%），加入后立即旋渦混合。
4	將試管蓋好，將試管放到37℃水浴箱內(nèi)溫育15分鐘。
5	在每一試管中加入2ml已稀釋好的檢測緩沖液，旋渦混合
6	1500×g下離心10分鐘
注意	準備好的樣品必須立即檢測。其上清可在18-25℃下穩(wěn)定存放1小時。

8.3.2樣品B：無血小板血漿

1	將50ul樣品B加入到玻璃試管中。
2	在每一試管中加入100ul稀釋好的檢測緩沖液，旋渦混合。
3	在每一試管中加入25ul酰化試劑，加入后立即旋渦混合。
4	將試管蓋好，將試管放到37℃水浴箱內(nèi)溫育15分鐘。
5	在每一試管中加入1ml已稀釋好的檢測緩沖液，旋渦混合
6	1500×g下離心10分鐘
注意	準備好的樣品必須立即檢測。其上清可在18-25℃下穩(wěn)定存放1小時。

9、實驗步驟

9.1簡短操作步驟（僅供樣品A使用，不能應(yīng)用于血漿）

1	將標準品、酰化好的質(zhì)控品和酰化好的樣品各50ul加入到相應(yīng)的微孔中。
2	在每一微孔中加入50ul五羥色胺生物素。
3	在每一微孔中加入50ul五羥色胺抗血清。
4	蓋板，室溫（18-25℃）下振蕩（500rpm）溫育90min。
5	移去粘性金屬板，棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，每孔用250ul稀釋好的洗滌液洗板3次,吸水紙上拍干以除去殘余液體。
6	在每一微孔中加入150ul臨時準備好的酶聯(lián)物。
7	蓋板，室溫（18-25℃）下振蕩（500rpm）溫育60min。
8	移去粘性金屬板，棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，每孔用250ul稀釋好的洗滌液洗板3次,吸水紙上拍干以除去殘余液體。
9	如果有條件的話，可以用8道移液器加底物液和終止液。加底物液和終止液時，每孔間的時間間隔應(yīng)當相同。使用主動置換型移液器并避免氣泡產(chǎn)生。
10	在每一微孔中加入200ul臨時配置好的PNPP底物液。
11	室溫（18-25℃）下振蕩（500rpm）溫育60min。
12	在每一微孔中加入50ul PNPP終止液以終止底物反應(yīng)，輕輕振板以使溶液混合均勻。
13	加終止液后60min內(nèi)405nm處讀取OD值。

9.2可選操作步驟（溫育一整夜，樣品A和樣品B均適用）

9.2.1*天

1	將標準品、酰化好的質(zhì)控品和樣品分別50ul加入到相應(yīng)的微孔中。
2	在每一微孔中加入50ul五羥色胺生物素。
3	在每一微孔中加入50ul五羥色胺抗血清。
4	蓋板，輕輕振板，2-8℃下溫育16-20小時（一整夜）。

9.2.2第二天

1	移去粘性金屬板，棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，每孔用250ul稀釋好的洗滌液洗板3次，吸水紙上拍干以除去參與液體。
2	在每一微孔中加入150ul臨時配置好的酶聯(lián)物。
3	蓋板，室溫振蕩器上（500rpm）溫育60分鐘。
4	移去粘性金屬板，棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，每孔用250ul稀釋好的洗滌液洗板3次，吸水紙上拍干以除去殘余液體。
5	如果有條件的話，可以用8道移液器加底物液和終止液。加底物液和終止液時，每孔間的時間間隔應(yīng)當相同。使用主動置換型移液器并避免氣泡產(chǎn)生。
6	在每一微孔中加入200ul臨時配置好的PNPP底物液。
7	室溫振蕩器上（500rpm）溫育30分鐘。
8	在每一微孔中加入50ul PNPP終止液，振板以混合孔內(nèi)成分。
9	加終止液后60min內(nèi)405nm處讀取OD值。（參考波長：600-650nm）

10、結(jié)果計算

將所有標準品、質(zhì)控品和樣品的OD值減去空白孔的OD值。在半對數(shù)坐標紙上，以標準品的OD值（Y軸，線性）對其濃度（X軸，對數(shù)）繪制出一條標準曲線，或采用自動計算的方法繪制出一條標準曲線。用Cubic spline、4參數(shù)或雙對數(shù)可以得到較好的曲線圖。在計算標準曲線時，應(yīng)當應(yīng)用到每一個標準品數(shù)值（兩個數(shù)值中，明顯逸出的數(shù)值應(yīng)當被忽略掉，采用更加合理的一個數(shù)值用）。樣品的濃度可以從標準曲線上定量得到。

由于樣品被稀釋了，所以zui終樣品結(jié)果必須乘以相應(yīng)的稀釋因子，單位為ng/ml。

血清、尿液、血小板、組織勻漿、細胞培養(yǎng)上清、質(zhì)控品： ×107

無血小板血漿： ×23.5

進行了進一步稀釋的樣品結(jié)果應(yīng)當乘以相應(yīng)的稀釋因子。

實驗必須滿足如下標準才符合要求：

50%OD/Odmax（ED50）：0.60-1.00ng/ml（平均0.8ng/ml）

△OD標準品A-標準品G≥0.80OD

轉(zhuǎn)換系數(shù)：

五羥色胺（ng/ml）×5.67=nmol/l

如果樣品中五羥色胺濃度高于zui高標準品，則此樣品必須按照實驗前準備說明進行稀釋并重新檢測。

11、期望值

實驗結(jié)果不能當作任何治療結(jié)果的*原因，疾病的判斷還應(yīng)當與其它臨床觀察和診斷檢測相結(jié)合。以下結(jié)果為正常人群的正常值（97.5%）：

樣品

數(shù)量

單位

平均值

建議每個實驗室讀確定自己的正常值范圍

范圍

血清

ng/ml

88.6

30-200

無血小板血漿

ng/ml

3.7

1.8-7.5

血小板

ng/10⁹血小板

490

217-861

24小時尿液

μg/d

83.1

≤200

本譯文僅供參考，詳情請以原文為準。

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