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北京西美杰科技有限公司
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更新時間：2025-04-24 16:44:12瀏覽次數：65
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糖蛋白分離純化——APB親和填料
蛋白糖基化是一種非常重要的蛋白質后修飾方式。糖基化對蛋白質的理化性質和生物功能都可以產生重大影響，生物藥分子的糖基化可能決定了其臨床效果，因此糖基化在生物藥生產中是一個關鍵質量屬性，必須在開發和生產過程中密切監視，并在工藝中特異性分離或者去除糖基化分子。近些年來，硼酸親和技術在糖蛋白純化領域得到了快速的發展，其親和性引起了研究人員的極大關注。由于硼酸基于與順式二醇基團可發生可控的可逆共價鍵合反應，后者在糖蛋白的糖鏈結構中廣泛存在，因而硼酸親和技術常被用做是一種選擇性富集分離順式二醇化合物的有效提純手段。硼酸親和作用的工作原理如下圖。
APB親和填料是由Astrea Bioseparations公司推出的配基為氨基苯基硼酸鹽的親和層析填料（Aminophenylboronate，簡稱APB），特別適用于糖蛋白的純化，或從非糖基化分子中去除糖蛋白和碳水化合物雜質，從而應對糖蛋白純化工藝中的各種挑戰，此外，APB填料還可用于純化和去除某些酶，例如硼酸基團對活性位點具有親和性的蛋白酶和水解酶等。
APB親和填料有兩種不同的基架可選擇，其中Aminophenylboronate P6XL采用的是Astrea專有的Purabead® P6XL近單分散瓊脂糖微球來生產高度穩定的交聯瓊脂糖基架。 Purabead®產品具有非常均勻的粒徑，可在低背壓條件下實現可重現的層析柱裝填和高流速。因此，Aminophenylboronate P6XL 是生物工藝應用的親和填料。Aminophenylboronate A6XL是Astrea的原創產品，該填料的瓊脂糖基質具有更寬的粒度分布，更適合小規模或診斷應用。兩種基架都是經過優化的，有相同的穩定的配基和偶聯物，都適用于各種生物制品的分離和純化。
APB親合填料產品特點
適用于親和純化或去除糖蛋白及聚糖
高純度m-氨基苯硼酸鹽配基
配基通過順式二醇選擇性結合至碳水化合物基團。
高動態結合載量
填料穩定性好，使用壽命長
可耐受0.5 M NaOH清潔，允許數百次循環使用
符合ISO 9001標準，批次穩定性重復性好
提供全面的法規支持文件（RSF），支持GMP生產和商業化申報
已有多個受監管的生物制藥生產和醫療診斷領域用戶使用。
pH穩定性:
APB親和填料在pH 3-13（連續暴露）范圍內穩定，并且可承受pH 14.0的間歇暴露。
在室溫條件下，在從pH 0.0(1 M HCl) 到pH 14.0 (1M NaOH) 的一系列測試溶液中孵育的APB A6XL的pH穩定性曲線。收集上清液樣品并以連續暴露1周至1年的特定時間間隔測定配基的脫落情況。
流速
APB P6XL的均勻粒徑使該吸附填料能夠在高線性流速下使用。可以使用高達500 cm/h的操作流速，盡管在層析柱上樣和洗脫期間的流速通常在50–200 cm/h范圍內。
APB P6XL（直徑3.2 cm x床高15 cm）的壓力-流速曲線。
結合載量
APB P6XL/A6XL對糖蛋白的結合載量范圍為10–20 μmol/g，對碳水化合物的結合載量高達30 μmol/g。
操作條件
糖蛋白與APB親和填料的結合在低至中等離子強度（10–300 mM）和弱堿性pH條件（pH 范圍8.0–9.5）下最佳。可以使用磷酸鹽制備的緩沖液，推薦使用硼酸鹽和甘氨酸進行柱平衡。建議結合流速在50–150 cm/h之間。吸附填料的結合載量取決于樣品的性質，對于糖蛋白來說，通常在10–20 μmol/g的范圍內。
通過使用低pH緩沖液或通過使用競爭性二醇，可以從APB親和填料中洗脫結合的蛋白質。可以使用pH4.0的0.1 M甘氨酸/HCl或0.1 M醋酸鹽緩沖液降低pH值進行洗脫。對于酸不穩定性蛋白質，可以使用合適的競爭性二醇，例如20–200 mM山梨醇，在中性pH緩沖液中進行洗脫。
糖蛋白分離純化——APB親和填料
APB親和填料參數
步驟 | 條件 |
平衡/裝柱緩沖液 | 50 mM磷酸鈉，pH 9.0緩沖液 |
蛋白質制備 | 在平衡緩沖液中制備蛋白質，并用≤0.45 μm的濾器預過濾。 |
操作流速 | 50-200 cm/h |
洗脫 | 20–200 mM山梨醇或0.1 M甘氨酸/HCI或0.1M醋酸緩沖液，pH 4.0 |
CIP | 0.5–1.0 M氫氧化鈉 |
預平衡 | 平衡緩沖液 |
消毒 | 0.5 M NaOH |
儲存 | 20% 乙醇 |
應用案例
用APB P6XL純化胎球蛋白
胎球蛋白是胎牛血清中的主要59 kDa糖蛋白，含有三個N-鏈和O-鏈碳水化合物側鏈。該案例介紹了使用APB P6XL層析柱從商品化粗溶液中純化胎球蛋白。
層析色譜圖
胎球蛋白層析條件參數：
層析柱高度：4 cm
柱體積：3.1 mL
線性流速：50 cm/h
平衡&漂洗緩沖液：50 mM磷酸鈉，pH 9.0
洗脫：山梨醇梯度(0–200mM)
消毒：1M NaOH
重組糖蛋白的捕獲
APB層析填料特別適用于糖蛋白的捕獲和純化。下圖展示了一個經典的親和純化色譜圖，其中有一個大的流穿和一個小的離散洗脫峰。在50 mM山梨醇洗脫后達到目標糖蛋白回收。
層析色譜圖
層析條件參數：
層析柱：直徑1.0 cmx柱床高7.4 cm
平衡漂洗/緩沖液：50 mM甘氨酸/NaOH pH 9.0
洗脫：50 mM 磷酸鹽緩沖液，0-200 mM山梨醇梯度
消毒：0.5 M氫氧化鈉
流速：200 cm/h
APB A6XL純化的糖蛋白Western blot結果圖（泳道1 分子量marker，泳道2 上樣到APB A6XL的樣品，泳道3 流穿液，泳道4-8 梯度洗脫液）
訂購信息
Aminophenylboronate P6XL
貨號 | 填料規格 | 產品形式 |
3355-00025 | 25 mL | 散裝填料 |
3355-00100 | 100 mL | |
3355-00500 | 500 mL | |
3355-01000 | 1 L | |
3355-05000 | 5 L | |
3355-10000 | 10 L | |
6716 | 1 x 1 mL | 預裝柱 |
6616 | 4 x 1 mL | |
6717 | 1 x 5 mL | |
6617 | 4 x 5 mL |
Aminophenylboronate A6XL
貨號 | 填料規格 | 產品形式 |
0355-00025 | 25 mL | 散裝填料 |
0355-00100 | 100 mL | |
0355-00500 | 500 mL | |
0355-01000 | 1 L |
Astrea Bioseparations于1987年孵化自劍橋大學，擁有超過30年層析介質研發和生產經驗，是層析介質產品與服務供應商。目前使用Astrea的產品已有超過21個生產工藝通過了FDA和EMA的批準。Astrea Bioseparations在全球擁有3個研發和生產基地，專注為生物大分子和CGT領域提供行業層析介質和技術服務。Astrea Bioseparations推出的基于納米纖維的新型層析技術，解決了傳統生物分離工具載量低和工藝耗時問題，實現更快、更環保、更具成本效益的純化過程，符合當今生物治療創新的需求。
西美杰是Astrea Bioseparations中國區代理，為用戶提供完善的技術支持與售后服務。
