本文主要介紹了使用THUNDER Imager Model Organism和small volume computational clearing（SVCC）對雞胚中的神經元祖細胞進行清晰、快速的成像，有助于相關信號通路的研究。相關的信號分子間的協同作用會導致未指明的祖細胞形成離散的組織和器官，以及胚胎神經細胞的模式化。目前還需要繼續研究胚胎發育的潛在分子和細胞機制，以開發并改進復雜先天性疾病的診療方法。在整個胚胎的遺傳操作過程中，可使用先進的顯微鏡在高分辨率下檢查離散的模式化中心和信號分子。
簡 介
胚胎神經系統的模式化是通過相關的信號分子間協同作用來完成的，包括音猬因子，這會導致未指明祖細胞形成離散的組織和器官[1，2]。盡管對胚胎發育的理解取得了巨大的進展，但仍然需要對潛在的分子和細胞機制進行大量的研究，以改進復雜先天性疾病的診斷和最終治療方式。
研究者一般會關注胚胎細胞群的機制研究。通常，研究者會通過操縱整個胚胎的遺傳因子來實現研究相關機制，那么我們可以使用先進的顯微鏡在高時空分辨率下操縱并檢查生成音猬因子和其他信號分子的離散模式中心。
本文主要介紹了使用THUNDER Imager Model Organism對雞胚中神經組細胞進行高對比度快速成像如何協助信號通路的研究。
挑 戰
在胚胎信號通路研究中，能夠快速對整個胚胎樣本進行清晰的3D成像的解決方案最為實用。這些圖像必須是無模糊或離焦的信號，這樣才能清晰分辨重要的細節。傳統的寬場顯微鏡雖然可對厚樣本（如整個胚胎）進行快速成像，并有一定的檢測靈敏度，但模糊的離焦熒光信號會導致圖像的對比度大幅下降[3，4]。
方 法
本研究中使用的樣本是6天大的雞胚腦。該胚胎表達了一種核mScarlet紅色熒光蛋白（RFP）和一種音猬因子調控的膜相關增強型綠色熒光蛋白(EGFP)，以離散地標記神經元祖細胞群。作者利用THUNDER Imager Model Organism的景深擴展（EDoF）功能采集了腦樣本的立體和宏觀圖像，并對圖像進行了small volume computational clearing（SVCC）處理。
結 果
使用THUNDER Imager采集的雞胚腦樣本結果如下圖1所示。
圖1：mScarlet RFP和音猬因子調控的EGFP標記的神經祖細胞雞胚腦圖像：A) Computational clearing處理前的原始寬場EDoF結果；B)SVCC處理后的結果。圖片來源：Timothy Sanders醫學博士兼哲學博士，美國芝加哥大學格羅斯曼神經科學、定量生物學和人類行為研究所。
雞胚腦樣本的THUNDER圖像無模糊信號，并能清晰顯示結構細節，有助于破譯對發育生物學與遺傳學非常重要的信號通路。
參考文獻：
1.T. Sanders, E. Llagostera, M. Barna, Specialized filopodia direct long-range transport of SHH during vertebrate tissue patterning. Nature (2013) vol. 497, pp. 628–632, DOI: 10.1038/nature12157.
2.S. Agarwala, T. A. Sanders, C.W. Ragsdale, Sonic Hedgehog Control of Size and Shape in Midbrain Pattern Formation, Science (2001) vol. 291, iss. 5511, pp. 2147-2150, DOI: 10.1126/science.1058624
3.J. Schumacher, L. Bertrand, THUNDER Technology Note: THUNDER Imagers: How Do They Really Work? Science Lab (2019) Leica Microsystems
4.L. Felts, V. Kohli, J.M. Marr, J. Schumacher, O. Schlicker, An Introduction to Computational Clearing: A New Method to Remove Out-of-Focus Blur, Science Lab (2020) Leica Microsystems
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