徠卡顯微系統(tǒng) 應用專家 肖麗國
2020年，似乎來得更艱難一點。從去年12月份開始，疫情就像龍卷風一樣席卷，當前已在217個國家地區(qū)蔓延，確診超2402萬例，死亡破82萬例。疫情構(gòu)成大流行的威脅“已經(jīng)變得非常真實”。
WHO Coronavirus Disease Overview
數(shù)據(jù)來源：World Health Organization，Date by 2:44pm CEST, 27 August 2020
疫情之下，奔跑在一線的有我們的白衣天使，也有爭分奪秒的科研人員。而在整個疫情的防控防治過程中，電鏡技術，讓病毒無所遁形。
負染色技術—鑒定病毒形態(tài)
為什么是冠狀病毒？
電鏡給了一個很重要的指標：病毒形態(tài)。
1月6日，中國疾病預防控制中心通過對臨床患者分離毒株樣品進行電鏡負染色，發(fā)現(xiàn)了病毒的存在，且形狀與冠狀病毒相似，直徑80-120nm，表面有皇冠一樣的突起，這就給我們一個很重要的方向指示。隨后，根據(jù)核酸序列比對以及其他鑒定方法，宣布疫情病毒肺炎疫情爆發(fā)。
圖片來源：中國疾病預防控制中心
負染色技術可以鑒別病毒形態(tài)、純度和濃度
負染技術流程簡單，檢測速度快。一般幾分鐘就可以完成。
載網(wǎng)要求：
1、載網(wǎng)親水：商業(yè)化載網(wǎng)表面有油脂，懸液樣品鋪不開
2、碳膜載網(wǎng)：促進樣品顆粒均勻分布
徠卡高真空鍍膜儀，一機兩用：鍍膜+輝光放電
EM ACE系列鍍膜儀（Leica EM ACE200）
負染技術—徠卡解決方案
冷凍電鏡技術—指導藥物和疫苗設計
疫情病毒表面的S蛋白，是侵染宿主的關鍵蛋白，與SARS病毒S蛋白一樣，都將宿主細胞表面的“血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）”作為侵入細胞的關鍵受體。了解S蛋白的結(jié)構(gòu)，弄清楚S蛋白與ACE2的作用方式，是藥物開發(fā)和疫苗設計的重點。
2月15日，德克薩斯大學*分校McLellan團隊獲得了疫情病毒S蛋白三維結(jié)構(gòu)，分辨率達3.5埃，確定了該S蛋白是由S1和S2組成的三聚體。RBD是受體結(jié)合區(qū)域，存在多種構(gòu)象狀態(tài)。與SARS病毒S蛋白比較，兩者是不同的，但整體上仍具有較高的相似度。
隨后，作者又分別分析了兩個病毒S蛋白與ACE2的親和力，疫情病毒S蛋白與ACE2的KD（平衡解離常數(shù)）是14.7nM，SARS病毒S蛋白與ACE2的KD是324.8nM，KD越高，親和力越低，暗示著疫情病毒的傳染性要高于SARS病毒。
3月1日，華盛頓大學David Veesler團隊根據(jù)S蛋白存在多種構(gòu)象，重構(gòu)了3.0埃的close構(gòu)象，以及3.3埃的打開單個SB區(qū)的三聚體。
結(jié)果表明，疫情病毒S胞外區(qū)表現(xiàn)為一個16nm長的三聚體，三角形截面，與SARS病毒S蛋白非常相似。很多序列是保守的，設計針對這一結(jié)構(gòu)功能的抗體，可能會交叉反應中和這兩種病毒以及其他相似的冠狀病毒。
同時還發(fā)現(xiàn)S1和S2邊界處存在四個氨基酸殘基插入，從而引入了新的蛋白酶切位點。這就可能會增強病毒的可傳播性，更加科學地解釋了疫情病毒傳染力強的問題。
2月19日，西湖大學周強教授團隊獲得了ACE2的全長三維結(jié)構(gòu)，同時解析了S蛋白RBD和ACE2的復合物三維結(jié)構(gòu)，看清楚了它們的相互作用方式，這一步正式揭開了疫情病毒入侵人體細胞的神秘面紗。
“S蛋白像一座橋橫跨在ACE2表面，又像病毒的一只手，緊緊抓住ACE2，打開細胞大門”。
了解了鎖的結(jié)構(gòu)，接下來，就可以有針對性地設計鑰匙，設計藥物和指導疫苗的研發(fā)。技術流程與負染類似，但是樣品終要經(jīng)過投入冷凍，在低溫電鏡下進行觀察。
徠卡的EM GP2，就是一款專業(yè)的投入冷凍儀，通過對樣品的單邊或雙邊的平行吸附，實現(xiàn)樣品的快速均勻冷凍。包括生物樣品，工業(yè)溶劑、懸濁液、乳濁液、膠體樣品等。
冷凍電鏡技術—徠卡解決方案
結(jié)果展示：
樣品：蛋白
觀察方式：cryo TEM
樣品：病毒
觀察方式：cryo TEM
樣品：纖維
觀察方式：cryo TEM
樣品：細菌
觀察方式：cryo TEM
電鏡是微生物研究中*的工具，病原體的確定毋庸置疑在傳染病防控中占有地位，而電鏡檢查是確定病毒顆粒的金標準。電鏡研究，制樣先行。如果您想了解更多關于電鏡制樣與病原體研究的內(nèi)容，請與我們聯(lián)系吧！
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