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【試劑盒簡介】

禽流感病毒H5亞型（AIV-H5）RT-PCR 檢測試劑盒，采用反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR ）技術檢測禽組織、分泌物和排泄物中的AIV-H5，適用于AIV-H5的檢測、診斷和流行病學調查。

【試劑盒原理】

利用吸附柱提取RNA作為模板，在反轉錄酶的作用下，以引物為起點合成與RNA 模板互補的cDNA鏈；然后在DNA 聚合酶的作用下，經高溫變性、低溫退火和中溫延伸的多次循環，使特異DNA 片段的拷貝數放大數百萬倍。將擴增的DNA 片段進行電泳、染色后，在紫外燈下，肉眼可見DNA 片段的擴增帶。 

【試劑盒組份】

大盒 （室溫保存）	1. 裂解液	8mL	5. 洗脫液	500μL
	2. BME	85μL	6. 陰性對照	350μL
	3. 異丙醇	8mL	8. 吸附柱和收集管	12套
	4. 洗滌液	15mL	9. 0.2 mL 薄壁PCR 管	15個
小盒 （-20℃保存）	7. 陽性對照	350μL	10. RT-PCR 反應液A	200μL
	11. RT-PCR 反應液B	15μL	12. 陽性模板添加液	5μL

【試劑盒保存條件及有效期】

1. 大盒請保存于室溫，小盒請保存于-20℃。

2. 有效期為半年。 

【需自備的材料】

生理鹽水、組織研磨器、眼科剪、眼科鑷、一次性注射器、經焦碳酸二乙酯（DEPC ）處理的滅菌1.5mL 離心管和吸頭、瓊脂糖、TAE電泳液、染色液。

【注意事項】

1．各試劑請在規定的溫度儲存。

2．本試劑盒有效期為6個月，不要使用超過有效期的試劑。

3. 反復凍融試劑將降低檢測的靈敏度，建議3次內用完。

4．請嚴格按試劑盒說明書操作，移液、定時等全部過程必須精確。

5. 保存于-20℃的試劑使用前請*融化，并瞬離15s，使液體全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液體時移液器吸頭盡量在液體表面層吸取，使用后立即放回-20℃。

6．注意防止試劑盒組分受污染，試劑盒之間的組分不要混用。

7．RNA提取過程中，請戴口罩、勤換手套，盡量縮短操作時間。

【操作方法】

一、樣品制備

1 樣品采集：病死或撲殺的禽，取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織；待檢活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物，置于50%甘油生理鹽水中，2～8 ℃保存。（要求送檢病料新鮮，嚴禁反復凍融。） 

2 樣品處理： 

2.1 組織樣品的處理：每份組織分別從三個不同的位置稱取樣品約1g，用手術剪剪碎混勻后取0.1g于研磨器中磨碎，再加1mL生理鹽水繼續磨至無塊狀物；然后將樣品轉至1.5 mL滅菌離心管中，8000 rpm離心2 min，取200 µL上清于1.5 mL 滅菌離心管中。

2.2 全血樣品的處理：待血凝后取200 µL血清于1.5 mL 滅菌離心管中。

2.3 陽性對照的處理：混勻后，取100 µL于1.5 mL 滅菌離心管中。

2.4 陰性對照的處理：混勻后，取100 µL于1.5 mL 滅菌離心管中。

二、病毒RNA的提取

1. 往裂解液中加入77.6µL BME，充分混勻。（加入了BME的裂解液請放4℃保存）

2. 取已處理的樣品、陰性對照和陽性對照，分別加入600µL裂解液，充分顛倒混勻，室溫靜置10min 。

3. 加入600µL異丙醇，顛倒混勻。

4. 吸取650μL混合液轉入吸附柱中，12,000 rpm 離心45s，棄去收集管中液體，套回收集管。

5. 重復步驟4。

6. 向吸附柱中加入600µL洗滌液，12,000 rpm 離心45s，棄去收集管中液體，套回收集管。 

7. 重復步驟6。

8. 空柱12,000 rpm 離心2 min。 

9. 將吸附柱移入新的無RNA酶的1.5 mL離心管中，在膜*加入25µL洗脫液，室溫靜置1min，12,000 rpm 離心45s，獲得總RNA。 

三、RT-PCR

1. 反應體系配制：每份總體積20 µL，分別取16.8µL RT-PCR反應液A（用前混勻）、1.2µL RT-PCR反應液B和2µL模板RNA（陽性對照管加入1µL陽性對照RNA和1µL陽性模板添加液），混勻。

2. 反應程序：在PCR儀上運行以下程序：42 ℃ 45 min，95 ℃ 3 min ；95 ℃ 30 s 、50℃ 40 s 、72 ℃ 40 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。

四、電泳

1. 配制1.5%瓊脂糖凝膠。（請自備TAE電泳液、瓊脂糖和染色液。）

2. 向PCR產物中加入上樣緩沖液，混勻，取10μL混合物點樣于凝膠孔中，以5V/cm的電壓進行電泳。

3. 當溴酚蘭電泳至凝膠中下部時結束電泳，在紫外燈下觀察結果。

【結果判斷】

    陽性對照出現545bp擴增帶，陰性對照無帶出現（引物帶除外）時，實驗結果成立。被檢樣品出現545bp擴增帶為禽流感病毒H5亞型陽性，否則為陰性。