抗體偶聯藥物（antibody-drug conjugate，ADC）是由單克隆抗體（mAb）與高活性載荷（payload）通過化學連接子偶聯而成。單抗作為載體將小分子藥物靶向運輸到目標細胞中。由于其明確的靶向性、遞送治療藥物的有效性，ADC 藥物成為當前治療腫瘤疾病藥物的新方向。ADC 給藥后在生物機體內會以多種形式存在，包括 ADC、ADC 生物轉化產物、游離載荷、載荷-部分連接子及其相關代謝產物等。全面地了解 ADC 藥物的藥代動力學特性，對于 ADC 藥物的設計和開發至關重要。
Trastuzumab deruxtecan（DS-8201; ENHERTU®）是由第一三共和阿斯利康合作開發的新型 HER2 靶向 ADC。Deruxtecan 是毒性藥物 DX-8951 的衍生物（Dxd）和連接子馬來酰亞胺 -GGFG 肽的偶聯物，已被批準用于治療轉移性 HER2 陽性乳腺癌患者。
本文以 DS-8201 為例，利用 BioZen MagBeads 鏈霉親和素磁珠提取凈化方式，Biozen peptide XB-C18 分析，建立一種檢測總抗體和結合型載荷的 LC-MS/MS 定量分析方法。
MagBeads 活化
取圖 1. MagBeads 經過 PBS 清洗后，與生物素山羊抗人混合孵育后 PBS 清洗，磁力架棄去上清；
圖 1. MagBeads 原包裝
免疫捕獲
加入血漿樣本，混合孵育，磁力架棄去上清；
圖 2. 分散清洗
淋洗和洗脫
分別使用 PBS 和碳酸氫銨溶液清洗 MagBeads，磁力架棄去上清；用 0.1% TFA 震蕩洗脫，磁力架收集上清液；
圖 3. 磁力架棄去上清
酶解
總抗與 Payload 分別用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解：
酶解結束后，均加入 10% FA 乙腈終止，離心待上機測試。
色譜條件
色譜柱：Biozen peptide XB-C18（2.1 × 100 mm, 1.7 μm）；P/N: 
00D-4774-AN
流動相 A 相：0.1% 甲酸水溶液；
流動相 B 相：0.1% 甲酸乙腈溶液；
流速：0.3 mL/min；
柱溫：40 ℃；
質譜條件
質譜型號：SCIEX Triple Quad™ 6500系統
離子源類型：電噴霧離子源（ESI+）
掃描方式：多反應監測正負離子模式（MRM）
為獲得較好的穩定性和靈敏度，優化源氣參數及各化合物監測離子對、去簇電壓（DP）和碰撞電壓（CE）。
靈敏度和線性
用 DS-8201 配制基質曲線，該方法曲線濃度范圍為 0.6nM~600nM，經過前處理后上機檢測，得到總抗體和結合型 Payload 線性良好，R2 均大于 0.995（見下圖 4、5）。
圖 4. 總抗特征肽標準曲線
圖 5. Payload標準曲線
進樣曲線最高點后進空白溶液，總抗體定量肽段殘留在 0.09‰，小分子 payload 殘留在 0.14‰。兩者殘留均小于 LLOQ，滿足分析要求，LLOQ 和殘留色譜圖見圖 6~9。
圖 6. 總抗特征肽 LLOQ 定量離子色譜圖
圖 7. 特征肽殘留 XIC 色譜圖
圖 8. 結合型 payloadLLOQ 定量離子色譜圖
圖 9. Payload 空白殘留 XIC 色譜圖
方法回收率和基質效應
分別在大鼠血漿中添加低、中、高三個濃度 DS-8201 標品，外標法考察 MagBeads 的提取凈化回收情況見下表，回收率均在 75%~90% 間。通過對比空白基質溶液添加酶解標液和空白溶劑添加酶解后標液，評估提取后基質效應得到，基質效應為 96.5%，可以得到血漿樣本通過 MagBeads 提取凈化后基本上沒有明顯的基質效應。
表 1. 加標回收結果
化合物 | 加標濃度 nM | 回收率 % |
GPSVFPLAPSSK | 1.8 | 80.2% |
180 | 82.4% | |
600 | 86.8% | |
Dxd | 1.8 | 77.3% |
180 | 82.6% | |
600 | 87.1% |
討論
對于測定的總抗體、結合型載荷與 ADC 的生物轉化，一般采用將生物基質中的所有 ADC 大分子免疫捕獲出來，再進行后續酶解處理的方法。本文選擇的使用通用型人源二抗對 ADC 藥物進行提取捕獲。根據 ADC 濃度、基質復雜程度以及其他檢項的需要，還可以選擇抗載荷抗體與鏈霉親和素結合對偶聯抗體進行捕獲，從而更加提高方法的特異性和靈敏度。
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