類固醇激素，又稱甾體激素，是一類四環脂肪烴化合物，具有環戊烷多氫菲母核，因其在維持生命、調節性功能、對機體發展、免疫調節、皮膚疾病治療及生育控制方面的作用，臨床表征中經常會作為疾病診斷的參考，因此，相關激素在臨床樣本中準確的定性和定量分析就變得尤為重要。在上周的推文中，我們分享了用LC-MS/MS方法檢測臨床19種類固醇激素的解決方案，該方案的完整執行，離不開合適的前處理基礎，這周我們就為大家分享其中一種基于SPE的前處理方法。
整個SPE方案的考察過程中，我們對淋洗和洗脫方案進行了相應優化。對于淋洗方案，首先嘗試了甲醇與水的不同比例，從10%的甲醇/水增加到90%的甲醇/水，其中好的結果為30%甲醇/水的比例。而后接著嘗試了兩種洗脫方案，第一種為1%甲酸水淋洗后采用30%甲醇/水淋洗，第二種為30%甲醇/水淋洗后采用正己烷淋洗。對于所有淋洗方案來說，1%甲酸水淋洗后采用30%甲醇/水淋洗的方式回收率最佳。在洗脫方案中，同樣進行了一些嘗試，最終決定采用甲醇:乙腈（1/4）進行洗脫。以下為優化后的SPE方案：
| 步驟 | 操作 |
| 樣品預處理 | 500µL血清樣本與500µL 1%甲酸水混合 |
| 活化 | 1mL甲醇活化Strata-X, 33µm聚合物反相，30mg 96孔板（貨號: 8E-S100-TGB） |
| 平衡 | 1mL水 |
| 上樣 | 1mL預處理后的樣品（10µL內標） |
| 淋洗1 | 1mL 1%的甲酸水溶液 |
| 淋洗2 | 1mL 30%的甲醇/水溶液，真空抽干 |
| 洗脫 | 2X500µL甲醇:乙腈（1:4, V:V） |
| 氮吹濃縮 | 45℃ |
| 復溶 | 100µL 0.5mM的氟化銨水溶液/甲醇（60:40, V:V）溶液 |
圖3 Kinetex C18分離類固醇相關異構體總離子流圖
圖4 部分化合物標準曲線
表3 標準曲線，LLOQ和S/N結果匯總
Kinetex 2.6µm C18色譜柱在正離子和負離子模式下能對分析物提供8分鐘之內的高選擇性分析結果（見圖3）。具有相同質荷比的異構體也完成了分離。標準曲線線性良好，分析物R2均大于0.99（見表3）。三種濃度下的三份加標樣品的準確度為80%~120%。除DHEAS回收率為54%之外，其他所有分析物的低濃度加標樣品的回收率為81%~116%；除DHEAS回收率為61%之外，所有其他分析物中濃度加標樣品的回收率為80%~96%；除DHEAS回收率為59%之外，所有其他分析物高濃度加標樣品的回收率為82%~102%（見表4）。要提高DHEAS的回收率，就要采用不同的洗脫方案。分析物的加標樣品精密度（%RSD）均小于15%（見表5）。
PS: pre-spiked samples
PoS: post-spiked samples
表4 回收率及準確度結果
表5 精密度，基質效應和方法回收率結果
根據實驗結果，上述方法可作為血清中類固醇激素分析的一種高效、重現性良好的前處理方法。使用Strata-X 96孔板可以作為有效凈化手段，同時采用Kinetex 2.6µm C18, 50x3.0mm色譜柱可在8分鐘內對相關類固醇分析物進行有效分離，同時對異構體進行分離從而實現準確定量。
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