上海喆圖科學儀器有限公司
恒溫振蕩器在疫苗研發中用于病原體培養的實驗研究
檢測樣品：病原體
檢測項目：/
方案概述：疫苗研發的核心環節之一是病原體（如病毒、細菌）的體外擴增培養，需在可控條件下保持其活性及穩定性。恒溫振蕩器通過精準控制溫度和振蕩頻率，能夠優化病原體的生長環境，提高培養效率，是疫苗研發關鍵設備。
一、研究背景
疫苗研發的核心環節之一是病原體（如病毒、細菌）的體外擴增培養，需在可控條件下保持其活性及穩定性。恒溫振蕩器通過精準控制溫度和振蕩頻率，能夠優化病原體的生長環境，提高培養效率，是疫苗研發關鍵設備。
二、實驗目的
驗證恒溫振蕩器在特定病原體（如流感病毒H1N1）培養中的最佳參數組合（溫度、轉速、時間）；
評估培養后病原體的活性、濃度及純度，為后續疫苗滅活/減毒工藝提供基礎數據；
建立標準化操作流程（SOP），提升疫苗研發效率。
三、實驗材料與儀器
1. 主要儀器
恒溫振蕩器
生物安全柜
離心機
實時熒光定量PCR儀
酶標儀
2. 耗材與試劑
病原體樣本：流感病毒H1N1毒株（保存于-80℃超低溫冰箱）；
細胞培養基：MDCK細胞（犬腎上皮細胞）+ DMEM培養基（含2%胎牛血清、1%雙抗）；
檢測試劑：病毒核酸提取試劑盒、熒光定量PCR引物/探針、ELISA檢測試劑盒（抗H1N1 HA蛋白抗體）；
其他：無菌細胞培養瓶、離心管、移液槍及槍頭、生物廢棄物處理袋。
四、實驗步驟
1. 病原體活化與接種
樣本解凍：將凍存的H1N1病毒株于37℃水浴快速解凍，置于冰上備用；
細胞準備：將MDCK細胞鋪于T25細胞培養瓶，密度達80%時接種病毒（MOI=0.01）；
恒溫振蕩培養：
設置恒溫振蕩器參數：34℃（流感病毒適宜溫度），120 rpm（低速振蕩促進營養交換）；
將接種后的培養瓶放入振蕩器，持續培養48小時。
2. 樣品采集與處理
時間點設置：每12小時取樣一次（0h、12h、24h、36h、48h）；
取樣方法：
吸取1 mL培養液，12,000 rpm離心10分鐘，取上清（含游離病毒顆粒）；
沉淀細胞裂解后提取細胞內病毒。
3. 檢測與分析
(1) 病毒滴度測定（TCID50法）
將病毒上清梯度稀釋，接種MDCK細胞，觀察細胞病變效應（CPE），計算半數組織培養感染劑量（TCID50/mL）。
(2) 核酸濃度檢測（qPCR）
使用病毒RNA提取試劑盒提取樣本RNA；
采用H1N1特異性引物（如HA基因片段）進行熒光定量PCR，通過Ct值定量病毒拷貝數。
(3) 抗原表達量檢測（ELISA）
包被抗HA蛋白抗體，加入病毒上清，顯色后測定OD450值，對比標準曲線計算抗原濃度。
五、實驗結果與結論
1. 數據匯總
時間（h） | 病毒滴度（TCID50/mL） | 核酸拷貝數（copies/mL） | HA抗原濃度（μg/mL） |
0 | 1×103 | 1×10? | 未檢出 |
24 | 1×10? | 1×10? | 12.5±1.2 |
48 | 5×10? | 5×10? | 35.8±2.5 |
2. 結論分析
最佳培養條件：34℃、120 rpm、48小時培養后，病毒滴度達到5×10? TCID50/mL，抗原表達量顯著提升；
振蕩作用：低速振蕩（120 rpm）促進病毒與細胞接觸，避免靜置培養的局部營養耗竭；
溫度敏感性：34℃較37℃更利于流感病毒增殖（避免宿主細胞過快凋亡）。
3. 應用價值
該方案可為滅活疫苗提供高濃度、高活性的病毒原液；
標準化參數降低批間差異，提升疫苗生產的穩定性和效率。
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