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肝臟是藥物代謝的重要器官，體外代謝模型多以肝臟為基礎。其中，原代肝細胞作為一種肝臟體外模型，因具有較好的體外試驗重現性，基本維持了肝臟的代謝功能，特別是較好的保留了與體內一致的酶水平，成為了體外藥物試驗的“金標準”，廣泛應用于藥物代謝與毒理學等研究中。原代肝細胞分離常用的方法有直接剪切法、組織塊培養法和兩步膠原酶灌流法等。其中，兩步膠原酶灌流法因其對肝細胞損傷作用較小，肝細胞產率和存活率高，成為了分離原代肝細胞的經典方法。

原代肝細胞及其應用

原代肝細胞(Primary hepatocytes)是指從動物肝臟直接分離的肝實質細胞，是高度分化的細胞，具有豐富的酶系及多種特異性功能。原代肝細胞作為一種體外模型，具有其它體外模型不可替代的優點：

①與體內環境保持一致，酶量和輔助因子水平都是正常的生理濃度，可以在接近生理狀態的的情況下研究藥物的代謝和毒性；

②較好保留和維持了肝細胞的完整形態和肝細胞體外代謝活性，真實反應了體內的代謝情況；

③無須擔心動物實驗的倫理問題，亦可減少動物實驗所需要的的成本開支，實現了減少（Reduction）、替代（Replacement）、優化（Refinement）的3R倫理原則。

  原代肝細胞作為體外藥物試驗的“金標準”，廣泛應用于藥物代謝與毒理學等研究中：

  探討藥物在肝中的代謝途徑和藥物藥代動力學的研究；

  評價藥物和外源性物質對肝臟中細胞色素P450酶誘導作用并探討其誘導機制；

  預測和解釋藥物與藥物之間的相互作用；

  研究藥物的細胞毒性等。

原代肝細胞分離

原代肝細胞的分離是肝細胞體外實驗的重要基礎和關鍵步驟，如何獲得高活力、數量多的肝細胞，分離技術是關鍵的第一步。目前，原代肝細胞的分離方法有直接剪切法、組織塊培養法、胰蛋白酶離體消化法、兩步膠原酶灌流法（Seglen灌流法）等。

【直接剪切法】

原理：用手術剪或鋒利的刀片將肝臟切成小塊，然后用膠原酶或胰蛋白酶進行消化，分離得到肝細胞。

優點：操作簡單，適用于大量細胞的分離。

缺點：細胞損傷較大，純度較低。

【組織塊培養法】

原理：將肝臟組織切成小塊，在培養皿中加入含有特定生長因子的培養液進行培養，使組織塊貼壁生長，肝細胞逐漸從組織塊中游離出來。

優點：能夠保持細胞的天然狀態，適用于長期培養。

缺點：肝細胞密度不易掌控且組織塊能否游離出肝細胞無法確定。

【胰蛋白酶消化法】

原理：用胰蛋白酶或胰酶對肝臟進行消化，分離得到肝細胞。

優點：能夠較為徹-底地分解細胞間物質，獲得較純的肝細胞。

缺點：胰蛋白酶的價格較貴，成本較高。

【兩步膠原酶灌流法（Seglen灌流法）】

原理：用含有膠原酶的溶液通過門靜脈灌注到肝臟中，使肝實質細胞與間質分開，然后收集分離出的肝實質細胞。

優點：能夠分離出存活率高、形態好的肝細胞，適用于長期培養。

缺點：操作較為繁瑣，技術要求高，成本也相對較高。

其中，兩步膠原酶灌流法（Seglen灌流法）是Seglen于1976年在前人的基礎上改良形成的，它具有分離效果好，細胞產率高，存活率高，對細胞損傷小，細胞維持肝細胞特異性功能時間長等特點，是目前國際上流行的原代肝細胞分離方法。

兩步膠原酶灌注法先使用無鈣灌注液灌注，無鈣灌注液作為預灌液，可以將肝臟內的殘留血液灌注出，除去或者減少細胞間的鈣離子，以減少細胞間的粘著力。之后再使用含膠原酶灌注液進行灌注把組織中的細胞釋放出來。膠原酶在消化肝組織的同時解除了細胞間接觸抑制或活化了潛在的蛋白激酶、生長因子或受體，使肝細胞能逐漸適應消化分離過程中所發生的細胞、外環境及細胞的各種改變，這些改變對離體肝細胞修復、生長及功能有重要的促進作用，有利于肝細胞的培養。

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