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反相快速制備聚焦梯度優(yōu)化方法
檢測(cè)樣品：辣椒素的混合物
檢測(cè)項(xiàng)目：辣椒素
方案概述：在ACCQPrep®HP150系統(tǒng)使用自動(dòng)聚焦梯度發(fā)生器，人們無(wú)需再花時(shí)間開(kāi)發(fā)或優(yōu)化閃式色譜聚焦梯度方法。從單次運(yùn)行分析偵察的結(jié)果，由內(nèi)置工具自動(dòng)計(jì)算生成聚焦梯度，以確定是否能夠在NextGen系統(tǒng)上有效運(yùn)行特定的純化，以及制備型HPLC的聚焦梯度的計(jì)算或閃式色譜的純化。
摘 要
在ACCQPrep? HP150 系統(tǒng)使用自動(dòng)聚焦梯度發(fā)生器，人們無(wú)需再花時(shí)間開(kāi)發(fā)或優(yōu)化閃式色譜聚焦梯度方法。從單次運(yùn)行分析偵察的結(jié)果，由內(nèi)置工具自動(dòng)計(jì)算生成聚焦梯度， 以確定是否能夠在CombiFlash? NextGen 系統(tǒng)上有效運(yùn)行特定的純化，以及制備型 HPLC 的聚焦梯度的計(jì)算或閃式色譜的純化。當(dāng)使用 RediSep?制備型HPLC色譜柱與 RediSep Gold?相匹配的色譜柱，以確定樣品純化和計(jì)算閃式色譜聚焦梯度，在運(yùn)行時(shí)間為7 - 12min內(nèi)完成（取決于HPLC系統(tǒng)和所使用的色譜柱）。也可以使用分析型 HPLC 系統(tǒng)通過(guò)ACCQPrep 聚焦梯度生成器以計(jì)算快速色譜梯度（參見(jiàn)Teledyne ISCO 網(wǎng)站上的技術(shù)報(bào)告TN52）。
背景
反相快速色譜技術(shù)由于缺乏方法的快速開(kāi)發(fā)技巧而受到阻礙，正相快速色譜方法的開(kāi)發(fā)可以用薄層色譜 (TLC) 板完成，但如果樣品洗脫在超過(guò) 60% 的含水溶劑系統(tǒng)，反相薄層板需要很長(zhǎng)時(shí)間才能完成。另一種手段是直接在閃式色譜系統(tǒng)上開(kāi)發(fā)方法，但這會(huì)消耗大量溶劑和樣品；或者可以在分析 HPLC 系統(tǒng)開(kāi)發(fā)方法，然后轉(zhuǎn)移到閃式色譜系統(tǒng)，通常涉及多次嘗試并且需要相匹配的分析柱和閃式快速色譜柱（如應(yīng)用報(bào)告AN118 中所述）。使用配備RediSep Prep 色譜柱的ACCQPrep制備色譜上的梯度生成器工具，將避免了所有這些問(wèn)題，不僅節(jié)省時(shí)間、樣品和溶劑，而且對(duì)容易純化的樣品還可以使用快速制備系統(tǒng)進(jìn)行，這將避免大量的分離純化在高壓制備完成而導(dǎo)致ACCQPrep 系統(tǒng)的工作量壓力。實(shí)驗(yàn)和結(jié)果
使用以下流程開(kāi)發(fā)閃式色譜的聚焦偵察運(yùn)行梯度。1、在 ACCQPrep 上運(yùn)行聚焦梯度生成器，使用待純化樣本進(jìn)行純化。使用內(nèi)置聚焦梯度生成器，或者分析HPLC的聚焦梯度計(jì)算工具，如果使用 ACCQPrep 進(jìn)行偵察運(yùn)行，則使用流程“a”。流程“b”用于使用 ACCQPrep 校準(zhǔn)的 HPLC 系統(tǒng)。
a、使用 20x150 mm Redisep 制備色譜柱計(jì)算需純化的化合物的聚焦梯度。請(qǐng)注意，Redisep 制備色譜柱應(yīng)與 RediSep 反相色譜柱化學(xué)性能相匹配，從而避免色譜柱選擇性的差異。記錄開(kāi)始和結(jié)束聚焦梯度的點(diǎn)；這些值將用于快速閃式色譜系統(tǒng)。
b、確保 ACCQPrep 和分析HPLC已根據(jù)技術(shù)說(shuō)明 TN52 進(jìn)行校準(zhǔn)。
使用 2 x 50 mm 或 4.6x150 mm RedisSep Prep與閃式色譜柱化學(xué)性能相匹配的分析色譜柱，例如 RediSep Gold C8，C18 或 C18AQ。輸入ACCQPrep 中的目標(biāo)峰保留時(shí)間來(lái)計(jì)算聚焦梯度。記錄開(kāi)始和結(jié)束聚焦梯度的點(diǎn)；這些值將用于快速色譜系統(tǒng)。
2、判斷要純化的化合物與Z接近的雜質(zhì)之間是否有足夠的分離度，確定這一點(diǎn)的Z簡(jiǎn)單方法是計(jì)算雜質(zhì)和目標(biāo)的化合物的聚焦梯度，然后注意每種方法的聚焦梯度起點(diǎn)，如果雜質(zhì)梯度起始點(diǎn)的溶劑組成與目標(biāo)化合物相距超過(guò) 3% 的B，純化可以是在閃式色譜柱上運(yùn)行；否則將需要 ACCQPrep系統(tǒng)。起點(diǎn)梯度溶劑組成值的差別，不因ACCQPrep 使用內(nèi)部計(jì)算或使用外部 HPLC計(jì)算工具將是相同的。另一種評(píng)估所需的分離度方法取決于偵察梯度中的峰值保留時(shí)間的差異。確定偵察梯度斜率 m = (Ending %B – Start%B)/梯度時(shí)間。對(duì)于圖 1 中的示例是 (100-5)/6 = 15.8。因?yàn)槲覀円馕龅姆澹诳焖偕V柱需要達(dá)到3%的分離度，將 3 除以斜率，公式為：Δ%B = 3/m。圖 1 中為了達(dá)到 6 分鐘梯度，3/15.8 = 0.19，舍入到≈0.2 分鐘。這意味著峰值解析度在偵察梯度至少0.2分鐘，可用于CombiFlash NextGen 系統(tǒng)純化。
3、在CombiFlash NextGen 上加載和偵察運(yùn)行使用類(lèi)型相同的色譜柱，使用方法編輯器的創(chuàng)建以柱體積為單位的聚焦梯度，選擇和偵察運(yùn)行相同的溶劑，包括修飾劑，%B 的開(kāi)頭和結(jié)尾與聚焦梯度和ACCQPrep 梯度長(zhǎng)度，以柱體積為單位，如表 1 所列，當(dāng)固體上樣方式使用時(shí)，需要延長(zhǎng)梯度時(shí)間。
下面的例子使用了辣椒素的混合物，選擇達(dá)到快速色譜的分離度極限。
第一步是執(zhí)行偵察運(yùn)行，確定第一個(gè)洗脫峰的梯度在~7.5min時(shí)。使用RediSep 制備 20 x150 mm色譜柱 (PN 69-2203-810)用于偵察篩選運(yùn)行，水/甲醇梯度。
下一步是計(jì)算第一個(gè)洗脫峰聚焦梯度， 色譜圖作為例子。偵察運(yùn)行的峰值分離為 0.2min，對(duì)應(yīng)于 3%B 的差異計(jì)算出兩種化合物的梯度。
50 g RediSep Gold C18 色譜柱 (PN 69-2203-336) 加載到 CombiFlash NextGen，之后系統(tǒng)自動(dòng)識(shí)別，并調(diào)用此色譜柱運(yùn)行參數(shù)，偵察運(yùn)行的同樣溶劑用于此系統(tǒng)，漸變梯度修改到與ACCQPrep 的溶劑組成具有相同起點(diǎn)和終點(diǎn)的聚焦梯度，該色譜柱在結(jié)束時(shí)用至少 2.5 CV 的 B 溶劑洗滌運(yùn)行以清除強(qiáng)保留的化合物。
結(jié)論
僅使用來(lái)自用于評(píng)估樣品純度的篩選運(yùn)行的數(shù)據(jù)，和使用ACCQPrep 內(nèi)置的聚焦梯度生成器允許在 12min內(nèi)確定優(yōu)化閃式色譜的方法，該工具還允許用戶提前確定在快速色譜柱上運(yùn)行目標(biāo)化合物和Z近的雜質(zhì)之間是否有足夠的分離度，或者如果需要更高的分離度，ACCQPrep 是否為必需的；在給定的分離度下，ACCQPrep 計(jì)算的梯度可以用于閃式快速純化；或繼續(xù)運(yùn)行ACCQPrep。
ACCQ Prep HP150 高壓制備型HPLC色譜系統(tǒng)
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流速1-150 mL/min開(kāi)發(fā)分析方法和制備方法
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操作壓力可達(dá)6000 psi
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UV或UV/VIS基礎(chǔ)上選擇ELSD和MS檢測(cè)器
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一鍵生成聚焦優(yōu)化梯度
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純化時(shí)間Z小化，樣本回收率Z大化
快速中低壓制備色譜儀系列
CombiFlash? NextGEN系列快色液相制備色譜儀可從制備純化過(guò)程中進(jìn)行自動(dòng)識(shí)別色譜尺寸和類(lèi)型，提高制備實(shí)驗(yàn)效率，無(wú)論是在提純合成化合物、天然產(chǎn)品、肽或聚合物。直觀的PeakTrak軟件可在數(shù)秒內(nèi)開(kāi)始分離。根據(jù)要純化的樣品的類(lèi)型和數(shù)量選擇正相或反相柱，允許RFID標(biāo)簽載入運(yùn)行參數(shù)，確認(rèn)檢測(cè)器設(shè)置(UV, Vis, ELS和MS)，按下開(kāi)始，載入樣品，即可開(kāi)始自動(dòng)工作，無(wú)需人員值守。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)隨時(shí)更改參數(shù)？當(dāng)分離實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，依然可以修改參數(shù)，包括溶劑百分比、波長(zhǎng)、流速和運(yùn)行時(shí)間等，不需要進(jìn)行重復(fù)分離。
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流量300ml和壓力300psi
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允許運(yùn)行750 g或高達(dá)1-2kg的色譜柱
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以較高的壓力極限純化低溶解度的樣品
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12"或15"智能觸摸屏
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更寬動(dòng)態(tài)范圍的檢測(cè)器
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改進(jìn)的基線校正支持使用吸收性溶劑
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通過(guò)簡(jiǎn)化的用戶界面更快地處理
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節(jié)省空間：頂部托盤(pán)可容納四個(gè)4L的瓶子
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改進(jìn)的梯度曲線可減少多達(dá)50%的溶劑
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