產品簡介：

分子克隆（Molecular Cloning）是分子生物學領域的奠基性技術，它是利用質粒作為載體來克隆所需的 DNA 片段，并利用大腸桿菌作為宿主進行擴增，使 DNA 片段取之不盡。分子克隆技術極大促進了生物學的發展，但是，其缺點是耗時并且步驟繁多，從連接到重組子鑒定一般需要 3-7 天（取決于宿主細胞）。為克服此缺點，本公司根據滾環擴增原理開發了本產品。

產品特點：

1.即開即用，十分方便，用戶不需要辛苦摸索條件。

2.起始材料為 DNA 片段-載體連接產物或 DNA 片段自身環化產物，到擴增產物鑒定最快只需要 6 小時完成（擴增 4 小時+酶切鑒定 2 小時）。如果起始 DNA 少， 則需要更長的時間。

3.使用自備的 DNA 插入片段專一的引物，只擴增帶有 DNA 插入片段的重組質粒， 不擴增自連載體。如果連接反應時已經排除了載體自身環化，則可以使用本試劑盒提供的 RCA 引物。

4.適用于任何長度的 DNA，也適用于對宿主有毒的 DNA 和在宿主細胞內不穩定的重復 DNA。

5.不需要感受態細胞。

6.所得質粒 DNA 沒有任何 RNA、宿主 DNA 或內毒素的污染。

7.高保真，所得 DNA 跟分子克隆制備的 DNA 一樣的保真率。

8.所得 DNA 可以直接用于酶切、一代和二代測序、轉染和酵母轉化。酶切和自身環化后還可以轉化大腸桿菌。

9.含熒光染料，可以實時檢測擴增的進行。

10.本產品足夠 50 次 10uL 體系的免克隆質粒制備反應。

11.通用免克隆質粒DNA制備試劑盒只能用于科研。

產品參數：

成份規格包裝

dNTP-染料混合液75 uL0.5mL 藍蓋管

RCA 專用隨機引物溶液100 uL0.5mL 白蓋管

phi29 DNA 聚合酶，10U/uL25 uL0.5mL 紅色管

10×Phi29 DNA 聚合酶緩沖液50 uL0.5mL 綠色管

使用手冊1 份無

運輸及保存

低溫運輸，-20℃保存,有效期為一年。

自備試劑

插入片段專一性引物、超純水。

使用方法：

1.用常規方法進行插入片段和克隆載體的連接。由于本產品基于滾環擴增，故只能  擴增沒有切口的環狀的 DNA。因此在連接時，需要注意兩點：一是最好通過粘性末端不同或堿性磷酸酶處理載體，防止載體自連，這樣就可以使用本試劑盒提供  的 RCA 專用隨機引物，不必再合成插入片段專一的引物。二是樣本中必須有一條沒有任何切口，變性后還是環狀單鏈的 DNA。常規的 AT 克隆，由于 PCR 片段的兩個 5’端沒有磷酸化，所以連接后重組質粒的四個切口其實只連接上了兩個，另外兩個并沒有連接上。這種帶切口的重組質粒并不影響轉化，但不能進行RCA 擴增，因為 DNA 變性后兩條 DNA 鏈其實還是線狀 DNA。所以這種 PCR 片段需要先磷酸化，或者 PCR 的時候就用 5 端磷酸化的引物，這樣連接后才能用于 RCA 擴增。

2.按下表設置 10uL 的環狀 DNA RCA 反應：

成分管 1

（樣本）管 2

（無模板對照）

連接產物，100pg1 uL-

RCA 專用隨機引物溶液2 uL2 uL

自備 DNA 插入片段專一性引物（注）40pmol40pmol

dNTP-染料混合液1.5 uL1.5 uL

10×Phi29 DNA 聚合酶緩沖液1 uL1 uL

加超純水到到水到 9.5 uL加水到 9.5 uL

在 PCR 儀器上 95℃ 3 分鐘，放室溫待溫度下降到常溫后加入

phi29 DNA 聚合酶，10U/uL0.5 uL0.5 uL

合計10 uL10 uL

注：自備引物的方向跟常規 PCR 的方向相反，長度只要 6-10 個堿基即可。使用時必須跟本試劑盒提供的 RCA 專用隨機引物共同使用。

3.放熒光定量 PCR 儀器上，設置 30℃保溫 16 小時，每 10 分鐘設置成一個循環， 采集一次 SYBR 通道的熒光信號。由于是實時檢測反應，所以反應不一定要 16 小時后終止，可以在擴增曲線進入平臺期后（已經沒有新的 DNA 合成）提前結束。如果沒有熒光定量 PCR 儀器，則只能電泳檢測或 PCR 檢測是否有擴增。

4.典型實驗結果。有擴增的樣本將有平緩的 S 熒光曲線，無模板對照將沒有此標準擴增曲線（見下圖）或擴增曲線：

5.65℃保溫 10 分鐘滅活 phi29 DNA 聚合酶。由于 phi29 DNA 聚合酶有很強的 3-5 外切酶活性，因此必須滅活，否則它將逐漸降解已經合成的 DNA。

6.擴增所得質粒 DNA 為超分支結構，直接電泳就是模糊一片，并不能進行分析鑒定。因此必須先酶切再電泳。可以選擇跟常規重組子鑒定一樣的酶進行酶切電泳，  也可以用菌落 PCR 一樣的方法進行菌落 PCR 來判斷是否克隆成功。擴增產物也可以直接用于轉染、酵母轉化、一代或二代測序。如果轉化大腸桿菌，則需要先用只酶切重組質粒一次的限制性內切酶酶切，再自連，再轉化。也可以用超純水將 1uL 擴增產物稀釋 100 倍后再用 1uL 稀釋液作為模板，再進行 RCA 擴增，得到更多的 DNA。

選擇我們的通用免克隆質粒DNA制備試劑盒，就是選擇精準、高效、可靠的檢測方案，為您的科研實驗保駕護航！