諾博萊德 Script III RT Kit With gDNA Eraser反轉錄

Script III RT Kit With gDNA Eraser（Perfect for qPCR）

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產品內容

保存條件

-20℃保存，有效期 12 個月。

具體產品的參數以收到產品說明書的參數為準

產品簡介

Script III RT Kit With gDNA Eraser是一種高效、穩定、快速并可以去除基因組DNA污染的反轉錄系統。本產品具有強大的基因組清除能力，碰到基因組殘留較多的RNA樣本時，這款逆轉錄試劑盒是最you選擇。只需兩步操作，17分鐘就可以完成基因組清除和逆轉錄反應，操作方便快捷，逆轉錄產物兼容染料法和探針法qPCR，用于檢測高拷貝或低拷貝基因。

本品采用第三代高效逆轉錄酶和熱敏型dsDNase，針對qPCR進行特別優化oligo dT和N6隨機引物配比，使cDNA合成可從RNA轉錄本的各個區域起始并具有相同的逆轉錄效lv，最da程度保證了qPCR結果的真實性和可重復性。

其中5x RT MasterMix為一管式逆轉錄預混液，含有逆轉錄所需的所有試劑（Script III Hˉ RTase、RNase Inhibitor、Random primers、Oligo dT Primer、dNTP Mixture、RT Buffer）。

注意事項

1． 本產品適用于包含 Ploy (A)結構的真核生物 mRNA 和不包含 Ploy (A)結構的原核生物RNA、真核生物rRNA和tRNA等模板，但不適用于miRNA等小 RNA 模板。

2． 避免 RNase 污染。

3． 為保證反轉錄成功，建議使用高質量的 RNA 樣品。

4． 20μl 逆轉錄反應體系建議加入不超過 1μg 的 Total RNA。如果目的基因的表達量非常低，最多加入 5μg Total RNA，否則，RNA 量過高，可能會超出后續 qPCR 的線性范圍

5． 建議使用 0.2ml RNase-free PCR 管在冰上配制反應液，并用 PCR 擴增儀精準控溫。

6． 5x RT MasterMix 和 4x gDNA Eraser Mix 含有高濃度甘油，比較粘稠，容易吸附在管壁和吸頭外，導致損失，用前請點甩離心后取用。5x RT MasterMix 和 4x gDNA Eraser Mix 內包含的酶過量，即使每次分別按照 3.8 μl、0.9 μl 使用，也不影響使用效果。

第一連 cDNA 合成 (以 20 μl 反應體系為例)

重要提示：操作前，請將各組分輕彈混勻，點甩離心后置冰上備用。

1． 去除基因組DNA

于冰上，在PCR管中，加入以下組分：

用移液器輕輕吸打混勻，42°C 孵育 2 min，以去除基因組 DNA 污染。

2． 逆轉錄反應

把步驟1的反應管放在冰上，加入4 μl 5x RT MasterMix，輕柔吸打混勻瞬離，設置反應程序：

① mRNA模板來源于真核細胞(植物、動物)，含有Poly(A)尾結構：42℃孵育15min；

② mRNA模板來源于原核細胞(細菌)、病毒，不含Poly(A)尾結構：25℃孵育10min；42℃孵育15 min。

注意：如果模板具有復雜二級結構或高GC區域，把42°C的孵育溫度提升至50°C，有助于提高產量。

3． 終止反應

85°C加熱5 sec，失活RTase和gDNA Eraser。

逆轉錄產物可立即用于qPCR反應，或保存于-20°C，并在半年內使用；長期存放，請分裝后存于-70°C。

qPCR

建議取1~2μl cDNA產物原液作為20μl qPCR反應體系的模板。如果基因表達量比較高，請根據實際情況適當稀釋cDNA模板后使用。

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