諾博萊德 III All-in-one RT Mix with dsDNase反轉錄

Script III All-in-one RT Mix With dsDNase（Perfect for qPCR）

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產品內容

保存條件

-20℃保存，有效期 12 個月。

具體產品的參數以收到產品說明書的參數為準

產品簡介

Script III All-in-one RT Mix With dsDNase是Script III RT Kit WithgDNA Eraser的升級版，只需一步操作， 僅需15分鐘就可以同時完成基因組清除與逆轉錄反應，操作方便快捷，逆轉錄產物兼容染料法和探針法qPCR，用于檢測高拷貝或低拷貝基因。

本品采用第三代高效逆轉錄酶和熱敏型dsDNase，針對qPCR進行特別優化oligo dT和N6隨機引物配比，使cDNA合成可從RNA轉錄本的各個區域起始并具有相同的逆轉錄效lv，最da程度保證了qPCR結果的真實性和可重復性。

其中5 x All-in-one RT Mix為一管式逆轉錄預混液，含有逆轉錄所需的所有試劑（Script III Hˉ RTase、RNase Inhibitor、Random primers、OligodT Primer、dNTP Mixture、RT Buffer）。

注意事項

1． 避免 RNase 污染。

2． 為保證逆轉錄成功，建議使用高質量的 RNA 樣品。

3． 20μl 逆轉錄反應體系建議加入不超過 1μg 的 Total RNA。如果目的基因的表達量非常低，最多加入 5μg Total RNA，否則，RNA 量過高，可能會超出后續 qPCR 的線性范圍

4． 本產品適用于包含 Ploy (A)結構的真核生物 mRNA 和不包含 Ploy (A)結構的原核生物RNA、真核生物rRNA和tRNA等模板，但不適用于miRNA等小 RNA 模板。

5． 5x All-in-one RT Mix 和 dsDNase 含有高濃度甘油，比較粘稠，容易吸附在管壁和吸頭外，導致損失，用前請點甩離心后取用。5x All-in-oneRT Mix 和 dsDNase 內包含的酶過量，即使每次分別按照 3.8 μl、0.9 μl使用，也不影響使用效果。

6． 建議使用 0.2ml RNase-free PCR 管在冰上配制反應液，并用 PCR 擴增儀精準控溫。

第一連 cDNA 合成 (以 20 μl 反應體系為例)

重要提示：操作前，請將各組分輕彈混勻，點甩離心后置冰上備用。

1． 反應體系的配制

于冰上，在PCR管中，加入以下組分：

用移液器輕輕吸打，充分混勻，點甩離心收集至管底。

2． 逆轉錄反應

① mRNA模板來源于真核細胞(植物、動物)，含有Poly(A)尾結構：42℃孵育15min；

② mRNA模板來源于原核細胞(細菌)、病毒，不含Poly(A)尾結構：25℃孵育10min；42℃孵育15 min。

注意：如果模板具有復雜二級結構或高GC區域，設置反應程序：

42°C孵育2 min（去除gDNA），50°C孵育15 min (逆轉錄)，有助于提高產量。

3． 終止反應

85°C加熱5 sec，失活RTase和gDNA Eraser。

逆轉錄產物可立即用于qPCR反應，或保存于-20°C，并在半年內使用；長期存放，請分裝后存于-70°C。

qPCR

建議取1~2μl cDNA產物原液作為20μl qPCR反應體系的模板。如果基因表達量比較高，請根據實際情況適當稀釋cDNA模板后使用。

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III All-in-one RT Mix with dsDNase反轉錄