Tissue/Cell RNA/ miRNA /DNA /Protein Mini Kit

動物組織/細(xì)胞 RNA/ miRNA/DNA/ Protein 共提試劑盒（免lv仿）

動物組織/細(xì)胞RNA/ DNA共提試劑盒 核酸提取

目錄號：91417

產(chǎn)品內(nèi)容

自備試劑

無水乙chun

保存條件

室溫（15 ~ 25℃）

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

產(chǎn)品簡介

Tissue/Cell RNA/ miRNA /DNA /Protein Mini Kit（免lv仿）適用于從各種動物組織、細(xì)胞中同時提取出 RNA/miRNA（包含 miRNA 的總 RNA）、基因組 DNA 和 Protein，提取全程不需要使用lv仿，得到包含 miRNA 的總RNA，不需要 DNase I 消化，可直接用于 miRNA 和 mRNA 的 RT、RT-PCR、RT-qPCR、RACE、芯片、測序等。基因組 DNA 也可以直接用于下游的Southern、mei切、PCR 等各種試驗(yàn)。

du特的裂解液迅速裂解細(xì)胞和滅活細(xì)胞 RNase/DNase，然后裂解混合物 RNA/miRNA/ DNA/Protein 同時通過一個 gDNA 吸附柱，基因組 DNA被吸附而 miRNA/RNA/Protein 穿透濾過。gDNA 吸附柱上的基因組 DNA經(jīng)過一系列漂洗、洗脫后得到純凈基因組 DNA。濾過的 RNA/miRNA，先用乙chun調(diào)節(jié)結(jié)合條件，然后轉(zhuǎn)入 RNA 吸附柱，在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于RNA 吸附柱上，接著通過一系列快速的離心-漂洗-離心-洗脫，得到純凈的RNA/miRNA（包含 miRNA 的總 RNA）。濾液經(jīng)選擇性沉淀得到 Protein。

注意事項(xiàng)

1. 采集 RNA 樣本時，把新鮮組織樣本浸入 RNAsafe (RNA 樣品保存液， 91115-100) 中，可在 37℃保存一天，在 25℃保存一周，在 4℃保存一個月，在-20℃或者–80℃長期保存。

2. 樣品應(yīng)避免反復(fù)凍融，否則會影響 RNA 的提取得率和質(zhì)量。

3. 提取時，RNA 在裂解液 MRL Plus 中時不會被 RNase 降解，但后續(xù)處理過程中應(yīng)使用不含 RNase 的吸頭和器皿。

4. 樣品在加入裂解液 MRL Plus 并勻漿后，可在–80℃保存一個月以上。

5. Wash Solution 2/3 可能加入乙chun使用幾天后，可能會出現(xiàn)沉淀晶體，并不影響使用，取其上清直接使用就可以。

重要提示：

① 第一次使用前, 請先在 Wash Solution 1、Wash Solution 2/3、漂洗液 WB 中加入zhi定量無水乙chun，詳見瓶上的標(biāo)簽。

② 所有離心步驟均需要在室溫（15~37℃）下進(jìn)行，提取效果更佳！

操作步驟

1. 動物組織：

a．電動勻漿：取新鮮組織 10~20 mg 加入 500 μl 裂解液 MRL Plus，電動勻漿，直到無明顯組織塊即可。

b．液氮研磨：液氮研磨組織成細(xì)粉，取 10~20 mg 組織細(xì)粉加入500μl 裂解液 MRL Plus，劇烈渦旋振蕩，直到無明顯粉末團(tuán)即可。

c． 將裂解物 13,000 rpm 離心 3 min，沉淀不能裂解的碎片。

d．下接操作步驟 3。

2. 細(xì)胞

a. 懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，加 500 μl 裂解液 MRL Plus（<8x106 細(xì)胞）, 吹打混勻，劇烈渦旋振蕩 20 sec，充分裂解。

b. 貼壁細(xì)胞：不需要消化，吸棄培養(yǎng)基后，直接在培養(yǎng)皿中加裂解液MRL Plus（每<8x106細(xì)胞加 500 μl 裂解液 MRL Plus）進(jìn)行消化、裂解；或者，先用胰mei消化后離心收集細(xì)胞，然后加入裂解液 MRL Plus，吹打混勻，劇烈渦旋振蕩 20 sec，充分裂解。

c. 下接操作步驟 3。

3. 將裂解勻漿物（或離心得到的上清）全部加入 gDNA 吸附柱中（吸附柱放入收集管中），13,000 rpm 離心 1 min，基因組 DNA 被吸附在膜上，保留濾液（RNA/ miRNA/Protein 在濾液中）。

把 gDNA 吸附柱放入 2.0 ml 離心管，置于 4℃度，以備提取 DNA 用。

以下是 RNA/miRNA 的提取步驟：（包含 miRNA 的總 RNA）

4. 向?yàn)V液中加入 1.25 倍體積的無水乙chun，用移液器吹打混勻。

5. 每次轉(zhuǎn)移≤750 μl濾液混合物至RNA吸附柱中，13,000 rpm離心1min，此時，RNA 被吸附在膜上，保留濾液，以備提取 Protein。

濾液中含有 Protein，請轉(zhuǎn)入一個合適大小（至少 2 倍濾液體積）的離心管，用于步驟 18 開始的 Protein 提取。

6. 加入 700 μl Wash Solution 1（檢查是否已加入乙chun），室溫放置 1 min, 13,000 rpm 離心 30 sec，倒棄濾液。

7. 加入 500 μl Wash Solution 2/3（檢查是否已加入乙chun），13,000 rpm 離心 30 sec，倒棄濾液。

8. 重復(fù)步驟 7。

9. 將 RNA 吸附柱放回空收集管中，13,000 rpm 離心 2 min，除去膜上殘留的乙chun。

10. 取出 RNA 吸附柱，放入 RNase-free 1.5 ml 離心管中，向 RNA 吸附膜的中央部位懸空滴加 30~50 μl 的 RNase-free H2O，室溫放置 1 min，13,000 rpm 離心 1 min，管底即包含 miRNA 的總 RNA。

11. 得到 RNA/miRNA，可直接用于下游實(shí)驗(yàn)，或于-70℃保存，以免降解。

以下步驟為提取 DNA 步驟：

12. 向步驟 3 的 gDNA 吸附柱中，加入 500μl 抑制物去除液 IR，12,000 rpm離心 30 sec，倒棄濾液。

13. 加入700 μl漂洗液WB（檢查是否已加入乙chun），12,000 rpm離心30sec，倒棄濾液。

14. 加入 500 μl 漂洗液 WB，12,000rpm 離心 30 sec，倒棄濾液。

15. 將 DNA 吸附柱放回空收集管中，13,000rpm 離心 2 min，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙chun抑制下游反應(yīng)。

16. 取出 gDNA 吸附柱，放入新的 1.5 ml 的離心管中，向吸附膜的中央懸空滴加 100 μl 洗脫緩沖液 EB（洗脫緩沖液事先在 65~70℃水浴中預(yù)熱效果更好），室溫放置 3~5 min，12,000 rpm 離心 1 min。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置 2 min，12,000 rpm 離心 1 min。

17. 得到的DNA可以存放在2~8℃，如果要長時間存放，可以放置在- 20℃。

以下步驟為提取 Protein 步驟：

18. 向步驟 5 的濾液中加入等體積的緩沖液 APP，渦旋振蕩混勻，室溫放置15 min 沉淀 Protein。

19. 13,000 rpm 離心 5~10 min，小心棄上清。加入 0.5ml 70%乙chun，顛倒混勻后，離心 1 min，小心棄上清，留下蛋白沉淀，盡量將殘留液體用移液器吸干凈。

20. 室溫晾干沉淀 5~10 min，注意一定讓乙chun揮發(fā)干凈，以免影響下游試驗(yàn)。

21. 將蛋白沉淀溶解于 30~150 μl 1x 蛋白上樣緩沖液（如需要蛋白定量，緩沖液中不應(yīng)該加入溴fen蘭）或其它下游試驗(yàn)要求的緩沖液中。

由于裂解液 MRL Plus 強(qiáng)變性作用或者不同蛋白等電點(diǎn)，蛋白可能溶解比較困難，用移液器吹打幫助溶解或者改變 PH 值幫助蛋白溶解，短暫離心取上清使用。或者用 5% SDS 或者 8M 尿素幫助溶解蛋白沉淀后做蛋白定量。如果需要 BCA 蛋白定量可能需要把 8M 尿素稀釋到 3M。

22. 95℃放置 5 min 溶解和變性蛋白，回復(fù)到室溫，最高速離心 1 min，取上清進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳或者 western blot 等試驗(yàn)。

與 RNA 相關(guān)的產(chǎn)品：

71118-100 Script III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（for PCR or qPCR）

71710-100 Script III All-in-one RT Mix with dsDNase（for qPCR）

71600-500 2x Universal SYBR Green qPCR Mix (適用于所有qPCR儀)

與 miRNA 相關(guān)的產(chǎn)品：

71418-25 Script III miRNA 1st Stand Synthesis Kit（加尾法）

71419-500 Script III miRNA Real-Time PCR Assay kit（for qPCR，加尾法）

71613-500 Script III miRNA RT-qPCR Detection kit（71418-25 + 71419-500）

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