支原體DNA檢測試劑盒（qPCR-熒光探針法）說明書

貨號： HG-ZY002

產(chǎn)品簡介：

支原體DNA檢測試劑盒可用于定性檢測主細胞庫、工作細胞庫、病毒種子批、對照細胞以及臨床治療用細胞中是否存在支原體污染。本試劑盒利用熒光探針法qPCR技術(shù)，參照EP2.6.7和JPXVII支原體檢測相關(guān)要求進行驗證，可覆蓋100多種支原體，且與密切相關(guān)的菌種無交叉反應(yīng)，檢測快速，在2h內(nèi)可完成檢測工作，專一性強。

規(guī)格：

50 Reactions

產(chǎn)品組成：

操作方法：

一、準備工作

• 試劑盒準備

將試劑盒各組分置于冰上或4℃，確保充分溶解開始操作。

• 需自備的耗材及設(shè)備

1. 熒光定量PCR儀、渦旋儀、離心機

2. 高精度移液器及一次性無菌無酶低吸附帶濾芯吸頭（0.1-2.5 µL、0.5-10 µL、10-100 µL、20-200 µL、100-1000 µL）

3. 1.5 mL 無菌無酶低吸附離心管

4. 無菌無酶八聯(lián)管或96孔qPCR板
   

二、操作流程

• 操作詳細步驟

1、待測樣本的提取：

建議使用譜新生物“支原體DNA樣本前處理試劑盒（HG-CL200）”提取樣本DNA。在加入樣本的同時，加入4 μL的內(nèi)控（Internal Control）。提取樣本時，建議同步提取DNA稀釋液作為陰性對照。

2、qPCR 反應(yīng)液的制備：

2.1 根據(jù)所需檢測的參考品和待測樣品數(shù)量（一般做2-3組復(fù)孔），計算反應(yīng)所需孔數(shù)：反應(yīng)孔數(shù)=（1個無模板對照NTC+1個陽性對照PC+待測樣品）×復(fù)孔數(shù) 

2.2 根據(jù)反應(yīng)孔數(shù)計算本次所需的qPCR MIX總量：qPCR MIX =（ 反 應(yīng) 孔 數(shù) +2 或 3）×12.5 μL（2×qPCR Reaction MIX）+（ 反 應(yīng) 孔 數(shù) +2 或 3）×2.1 μL（ 支 原 體 Primer&Probe MIX）+（反應(yīng)孔數(shù)+2或3）×0.4 μL（Internal Control）（2 或3為操作損失量） 

2.3 將所用試劑置于冰上完i全溶解，輕微振蕩混勻，瞬時離心，按下表所示配制：

【注】:如果在提取時已加入內(nèi)控，則配制qPCR MIX時，用等體積的DNA稀釋液代替。

2.4 將配制的qPCR MIX，輕微振蕩混勻，瞬時離心，按15 μL/孔分裝至八聯(lián)管或者96孔板中。
2.5 將 DNA 稀釋液按10 μL/孔加到分裝了qPCR MIX八聯(lián)管或者96孔板中。
已融化未使用的DNA 稀釋液可在2-8℃短暫保存，若長期不使用，請儲存于-20℃。

3、qPCR 加樣：

3.1 將所需試劑置于冰上操作，輕微振蕩混勻，瞬時離心，加樣（總體積25 μL）：

3. 2 實驗可使用無菌無酶的八聯(lián)管或者96孔板進行反應(yīng)，需去除反應(yīng)體系中的氣泡，并離心至管底準備反應(yīng)。

PCR程序設(shè)置

支原體檢測熒光基團選擇FAM，淬滅基團為None，內(nèi)控熒光基團選擇CY5，淬滅基團為None，參比熒光為ROX（根據(jù)儀器要求選擇）。
反應(yīng)程序：

程序中58℃ 34 s處設(shè)置為熒光收集；反應(yīng)體積25 μL。

結(jié)果分析

注意事項

1、本試劑盒已通過穩(wěn)定性（凍融等因素）的驗證，無需分裝。
2、陰性樣品（2×qPCR Reaction MIX、Primer&Probe MIX 和 DNA稀釋液等）和陽性樣品（PC和待測樣品等）的配制和加樣環(huán)境需區(qū)分區(qū)域，不可在一個區(qū)域內(nèi)操作，配制人員需穿戴整齊，戴好口罩、手套和穿好潔凈服。
3、注意在不同加樣步驟間及時更換吸頭，避免交叉污染，避免長時開蓋，使用移液器移液時，需避免液體掛壁。
4、試劑盒必須在有效期內(nèi)使用，不建議不同批次的相關(guān)試劑混用。
5、試劑盒內(nèi)所有組分建議在低溫環(huán)境融化后使用，且需確保其充分溶解，各組分使用前需充分混勻，以保證試劑的均一性，經(jīng)混勻的試劑需經(jīng)短暫離心，以使管壁及蓋子上的液體全部集中于管底。若發(fā)現(xiàn)DNA稀釋液中有析出物，建議于 37 ℃條件下進行孵育，使DNA稀釋液完i全溶解。
6、只有嚴格遵守說明書的操作方法，全部使用本試劑盒配套的試劑才能保證最佳檢測效果。
7、最終的試驗結(jié)果與試劑的有效性、操作者的操作方法及試驗環(huán)境密切相關(guān)。
8、公司只對試劑盒本身負責，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負責，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預(yù)留充足的樣本。
9、本試劑盒僅供體外研究使用，不用于臨床診斷。

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