FQ-PCR05 染料法qPCRMix 熒光定量
- 公司名稱 北京諾博萊德科技有限公司
- 品牌 NobleRyder/諾博萊德
- 型號(hào) FQ-PCR05
- 產(chǎn)地 北京
- 廠商性質(zhì) 生產(chǎn)廠家
- 更新時(shí)間 2025/3/29 8:58:13
- 訪問(wèn)次數(shù) 60
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| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 1mL / 5mL |
|---|---|---|---|
| 貨號(hào) | FQ-PCR05 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁,制藥/生物制藥 |
| 主要用途 | 是使用SYBR Green I 嵌合熒光法進(jìn)行qPCR的2×試劑。 |
諾博萊德 染料法qPCRMix
染料法qPCRMix 熒光定量
產(chǎn)品名稱：染料法qPCRMix
產(chǎn)品內(nèi)容：
| 組分 | FQ-PCR05-1 | FQ-PCR05-5 |
| 2× Universal SYBR qPCR Master Mix | 1 mL | 4×1.25 mL |
| DNase-free Water | 1 mL | 4×1.25 mL |
產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
2× Universal SYBR qPCR Master Mix是使用SYBR Green I 嵌合熒光法進(jìn)行qPCR的2×試劑。主要成分包括化學(xué)修飾的Hot Start Fast Taq DNA Polymerase、dNTP、Mg2+、SYBR Green I和針對(duì)qPCR優(yōu)化的最適Buffer。本產(chǎn)品可在寬廣的定量區(qū)域內(nèi)獲得良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好、可信度高。另外，預(yù)混液體系中添加了特殊ROX Reference Dye，適用于不同qPCR 儀器，配置反應(yīng)體系時(shí)只需加入引物和模板即可擴(kuò)增。
注意事項(xiàng)：
1. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
2. 請(qǐng)于使用前確保產(chǎn)品wan全解凍，che底混勻后短暫離心，置于冰上備用。
3. 反復(fù)凍融會(huì)影響產(chǎn)品性能。如每次用量較少，推薦小份分裝使用。
4. 本產(chǎn)品中含熒光染料SYBR Green I，使用中應(yīng)盡量避免強(qiáng)光照射。
實(shí)驗(yàn)流程：
配制檢測(cè)試劑
按照下表配置PCR反應(yīng)體系（注：配置多個(gè)反應(yīng)孔時(shí)，請(qǐng)為各組分預(yù)留10%的余量，以免移液損失。）
| 試劑組份 | 20μL體系 | 50μL體系 |
| 2× Universal SYBR qPCR Master Mix | 10 μL | 25μL |
| Forward Primer (10μM) | 0.4 μL* | 1μL* |
| Reverse Primer (10μM) | 0.4 μL* | 1μL* |
| 模板DNA/cDNA | X μL* | X μL* |
| DNase-free Water | As required | As required |
| Total Volume | Up to 20 μL | Up to 50 μL |
*通常每條引物終濃度為0.2 μM，也可根據(jù)情況在0.1~0.4μM 間進(jìn)行調(diào)整。
*微量體積加樣時(shí)誤差大，建議模板稀釋后再加入反應(yīng)體系中，這樣可以有效提高實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性；如模板類型為未稀釋cDNA原液，使用體積不應(yīng)超過(guò)qPCR反應(yīng)總體積的 1/10。
2. 反應(yīng)體系配好后，蓋好反應(yīng)蓋，充分渦旋混勻，離心，避免產(chǎn)生氣泡。
反應(yīng)程序設(shè)置
標(biāo)準(zhǔn)程序
| Stage | 步驟 | 溫度 | 時(shí)間 | 循環(huán)數(shù) |
| Stage 1 | 預(yù)變性/酶激活* | 95 ℃ | 5 min | 1 |
| Stage 2 | 變性 | 95 ℃ | 15 sec | 40 |
| 退火/延伸/采集信號(hào)* | 60 ℃ | 40 sec* | ||
| Stage 3 | 熔解曲線* | 儀器默認(rèn)程序 | 1 | |
快速程序
| Stage 1 | 步驟 | 溫度 | 時(shí)間 | 循環(huán)數(shù) |
| Stage 1 | 預(yù)變性/酶激活* | 95 ℃ | 5 min | 1 |
| Stage 2 | 變性 | 95 ℃ | 2 sec | 40 |
| 退火/延伸/采集信號(hào)* | 60 ℃ | 20 sec* | ||
| Stage 3 | 熔解曲線* | 儀器默認(rèn)程序 | 1 | |
*延伸時(shí)間請(qǐng)根據(jù)您使用的Real Time qPCR儀數(shù)據(jù)采集最短時(shí)間限制以及PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度自行調(diào)整。
*模板拷貝數(shù)較低時(shí)采用標(biāo)準(zhǔn)程序可提高數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性。
結(jié)果分析：
定量檢測(cè)至少需要三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，反應(yīng)結(jié)束后需要確認(rèn)擴(kuò)增曲線的線形，熔解曲線的峰形。
1. 擴(kuò)增曲線：標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線為S型。
Ct值小于10，需要將模板稀釋后，重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（每稀釋一倍，Ct值增大1）；
Ct值30-35之間時(shí)，需要提高模板濃度，或者增大反應(yīng)體系的體積，以提高擴(kuò)增效率，保證結(jié)果分析的準(zhǔn)確性；
Ct值大于35時(shí)，檢測(cè)結(jié)果不可信。
2. 熔解曲線：
熔解曲線單峰，表明反應(yīng)特異性好可以進(jìn)行定量結(jié)果分析；若熔解曲線出現(xiàn)明顯雙峰或者多峰，則不能進(jìn)行定量分析，需要重新設(shè)計(jì)引物。
常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案
?擴(kuò)增曲線形狀異常
①擴(kuò)增曲線不光滑：使用的八聯(lián)排管或PCR板可能與設(shè)備不匹配，設(shè)備光源可能松動(dòng)。
②擴(kuò)增曲線突然驟降：反應(yīng)管內(nèi)留有氣泡，樣本離心后仔細(xì)檢查反應(yīng)管內(nèi)是否有氣泡殘留。
?反應(yīng)結(jié)束無(wú)擴(kuò)增曲線出現(xiàn)
①循環(huán)數(shù)不夠：一般設(shè)置為40個(gè)循環(huán)。
②確認(rèn)程序中是否設(shè)置了信號(hào)采集步驟。
③確認(rèn)引物、模板是否降解。
?陰性對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增
①反應(yīng)體系污染：更換新的Mix、水、引物重復(fù)實(shí)驗(yàn)。在超凈工作臺(tái)進(jìn)行反應(yīng)體系配置，減少氣溶膠污染。
②產(chǎn)生引物二聚體，配合溶解曲線進(jìn)行分析。
③使用含UDG/dUTP 防污染體系的擴(kuò)增試劑。
?實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差
①加樣體積失準(zhǔn)：建議使用大體積加樣以減少誤差。
②模板濃度太低：模板濃度越低，重復(fù)性越差，減少模板稀釋倍數(shù)或增加模板體積。
③反應(yīng)體系未充分混勻：上機(jī)檢測(cè)前將反應(yīng)體系充分混勻后再離心。
染料法qPCRMix 熒光定量
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