產(chǎn)品簡介：

線粒體是真核生物產(chǎn)生能量的重要細胞器，它具有自身的基因組，線粒體DNA 和細胞核 DNA 共同決定真核生物的表現(xiàn)型，因此研究線粒體 DNA 具有重要的意義。本產(chǎn)品就是以探針法 qPCR 技術為基礎開發(fā)的專門檢測小鼠線粒體DNA 的試劑盒。

產(chǎn)品特點：

1.即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2.引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏性高，可以達到 100 拷貝/反應。

3.提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4.特異性高，引物是根據(jù)小鼠線粒體 DNA 高度保守區(qū)設計，不會跟其他生物的 DNA 發(fā)生交叉反應。

5.既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為 5 個數(shù)量級。

6.本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。

7.小鼠線粒體DNA探針法熒光定量PCR試劑盒只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

50T/盒，可滿足一定規(guī)模的檢測需求。

檢測方法

實時熒光PCR，具有快速、準確、靈敏等優(yōu)點。

試劑盒成分

2×Probe qPCR MasterMix、熒光 PCR 專用模板稀釋液、超純水、小鼠線粒體 DNA qPCR 引物-探針干粉、小鼠線粒體 DNA 陽性對照(1E7 拷貝/μL)、使用手冊。

自備試劑

超純水，樣品 DNA。

保存和運輸

低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 24 個月。

使用方法：

一、稀釋標準曲線樣品（以 1E1-1E6 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污  染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本  產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。1. 標記 6 個離心管，分別為 6，5，4，3，2，1。

2.用帶芯槍頭分別加入 45μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，

下同）。

3.在 6 號管中加入 5 μL 1E7 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1分鐘，得 1E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在 4 號管中加入 5 μL 1E5 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1E4 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

6.重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7.如果有 N 個樣品，最好設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性

對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 上步所得 4 號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟核酸制備試劑盒所要求的起始樣本體積  一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。

8.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)樣品 DNA-提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的核酸-提取試劑。

三、Probe qPCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）

9.如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標準曲線。如果做定性分析并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（直接用第 6 步第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10.在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設

置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好  后最后加）：

成分樣品管

N+2 個PCR

陰性對照標準曲線樣品管

（1-6 管）

2×Probe qPCR MasterMix各 10 μL10 μL各 10 μL

小鼠線粒體 DNAqPCR

引物-探針混合液各 3 μL3 μL各 3 μL

N+2 個待測 DNA 樣本各 7 μL不加不加

超純水不加7 μL不加

第 6 步所得標準曲線樣品稀釋液

（1-6 號）不加不加各 7μL（2 號樣

到 2 號管，3 號

樣到 3 號管…）

11.蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 PCR：

過程溫度時間

預變性95℃2 min

PCR 反應

（40 個循環(huán)）95℃15 sec

58℃30 sec（采集 FAM 通道的熒光

信號，設置 BHQ-1 為淬滅基團）

四、數(shù)據(jù)處理

12.如果樣本制備陽性對照或 PCR 陽性對照(包括標曲樣本)結果為陰性，則整個實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要重新樣本制備，重新進行 PCR 擴增或跟廠家聯(lián)系。如果樣本制備陰性對照或 PCR 陰性對照結果為陽性，說明環(huán)境污染，則整個實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要跟廠家聯(lián)系。

13.如果陰性對照和陽性對照均正常，則實驗有效，可以進入后續(xù)分析。

14.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

15.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照必須無 Ct 或 Ct 大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于 40，否則實驗無效。如果實驗有效，則分析待測樣品，如果無Ct 或 Ct 大于或等于 40，則為陰性。如果 Ct 小于 40 則為陽性。

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