諾博萊德 His-Tag蛋白純化磁珠（鈷離子） IDA-Cobalt

His-Tag蛋白純化磁珠（鈷離子）輔助試劑

產品貨號：M0198

產品名稱：His-Tag蛋白純化磁珠（鈷離子） IDA-Cobalt

產品規格：5mL/2×50mL

產品簡介：

具體產品的參數以收到產品說明書的參數為準

NobleRyderM0198 His-Tag蛋白純化磁珠（鈷離子） IDA-Cobalt具有超順磁性，專為高效、快速純化組an酸標簽蛋白而設計的一種新型功能化材料。可通過磁性分離方式直接從生物樣品中一步純化出高純度的目標蛋白，極大地簡化純化工藝和提高純化效率，適合科研和工業領域便捷地進行組an酸標簽蛋白純化。

與傳統層析方式使用的金屬螯合瓊脂糖預裝柱相比，采用磁珠純化組an酸標簽蛋白，無需對樣品進行多次長時間的高速離心和濾膜過濾、無需控制流速、更無需高昂的層析設備。樣品與磁珠的特異性結合、洗滌以及目標蛋白的洗脫變得簡單、快速、易操作。對于熟練的操作者而言，在 1h 內就能獲得高純度的目標蛋白，且能輕松實現高通量和大規模樣品的平行處理，為研究者節省了時間和成本。

本產品系列包括鎳離子（Nickel）、鈷離子（Cobalt）兩種金屬離子螯合磁珠，它們在目標蛋白結合量和非特異性吸附等性能上有所區別，用戶可根據目標蛋白與不同種類金屬的結合性能，以及對目標蛋白的產量和純度的要求，選擇不同種類的金屬離子螯合磁珠。

適用范圍：

適用于純化細菌、酵母、昆蟲和哺乳動物細胞等分泌或胞內表達的可溶性組an酸標簽蛋白，也可用于變性蛋白的純化（包涵體需變性后再進行純化）。

操作步驟：（僅供參考）

1、緩沖液的準備

目標蛋白與組an酸標簽蛋白純化磁珠的結合性能將直接影響目標蛋白的純化效率，而各種緩沖液配制也將在一定程度上影響目標蛋白的回收率和純度。因此，在較大規模蛋白純化之前，用戶應該自行設計實驗，篩選出適合純化目標蛋白的緩沖液體系，主要包括 BindingBuffer、WashingBuffer、Elution Buffer。

增加咪唑濃度進行洗脫是組an酸標簽純化磁珠*chang用的洗脫方法，shou次使用時，在不確定最佳的洗脫咪 唑濃度情況下，推薦在緩沖液中分別加入 10mM、20mM、50mM、100mM、200mM、300 mM、400mM、500mM mi唑，濃度從低到高分別洗脫，磁吸后收集蛋白上清液，之后通過 SDS-PAGE電泳等方法鑒定洗脫結果。

以下提供的緩沖液體系適用于多數組an酸標簽蛋白的純化，供用戶參考。

Binding Buffer： 20 mMPhosphateBuffer，500mMNaCl，5~50mMImidazole，pH7.4

 Washing Buffer： 20mMPhosphateBuffer，500mMNaCl，50~100mMImidazole，pH7.4

 Elution Buffer： 20 mMPhosphateBuffer，500 mMNaCl，500mMImidazole，pH7.4

 2、樣本處理

（1）大腸桿菌、酵母等細胞內表達蛋白：表達細胞用適量的 BindingBuffer 稀釋，加入蛋白酶抑制劑（如終濃度為 1mM 的 PMSF），重懸細胞，冰浴超聲裂解細胞，即為粗蛋白樣品。如果樣品過于粘稠，可根據需要在粗樣品中加入適量核酸酶，冰浴 30min，以降解核酸。另外，用戶也可以根據實際需要對蛋白樣品進行離心操作。

（2）胞外表達蛋白：取胞外表達上清，用等量 BindingBuffer 稀釋，即為粗蛋白樣品。

（3）動物細胞胞內表達蛋白：取適量動物細胞，先用適量 PBS 洗滌 1 次，棄上清；接著用適量含 1%（v/v） TritonX-100 或 1%（v/v） NP-40 的BindingBuffer 重懸，加入蛋白酶抑制劑（如終濃度為 1mM 的 PMSF），冰浴10min，即為粗蛋白樣品。

3、磁珠預處理

一般情況下，磁珠的使用量是由用戶根據目標蛋白產量和磁珠載量信息計算獲得。例如：采用大腸桿菌表達某目標蛋白，500mL 發酵液收獲 2g 濕重的菌體，通過預實驗估算其目標蛋白產量為 10～20 mg，用戶需要取 5mL 磁珠懸液用于目標蛋白的純化。以下即以此為例進行詳細說明：

（1）將磁珠產品置于漩渦混勻器上充分混勻，用移液器取 5mL 磁珠懸液于 15mL 離心管中，進行磁性分離*， 棄上清液，從磁性分離器上取下離心管。

（2）加入 5mLBindingBuffer 到上述裝有磁珠的離心管中，上下翻轉離心管數次，使磁珠重新懸浮；進行磁性分離，移去上清液。重復洗滌 2 次。

（*：在磁性分離過程中，為了減少磁珠在使用過程中的損耗，待溶液變澄清后，蓋緊離心管蓋子，保持離心管 仍在磁性分離器上，手持磁性分離器與離心管上下翻轉數次，使澄清的溶液涮洗離心管蓋上殘留的磁珠，靜置片刻， 使溶液重新變澄清；以下同。）

4、目標蛋白與磁珠結合

（1）用 10mLBindingBuffer 懸浮 2g 濕重的菌體，進行破碎和裂解之后，即為目標粗蛋白樣品，加入到裝有預處理磁珠的離心管中，將離心管置于漩渦混勻器振蕩 15s。

（2）將離心管置于旋轉混合儀上，室溫旋轉混合 20~30min（如果需要，可以在 2~8℃ 的低溫環境下，旋轉混 1h， 防止目標蛋白降解）。

（3）將離心管置于磁性分離器上進行磁性分離，移出上清液至新的離心管中以備后續檢測，從磁性分離器上取下離心管進行后續洗滌步驟。

5、磁珠洗滌

（1）加入 10mLWashingBuffer 到裝有磁珠的離心管中，輕輕翻轉離心管數次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，移出清洗液到新的離心管中，以備取樣檢測。重復此步驟 1 次。

（2）加入 10mLWashingBuffer 到裝有磁珠的離心管，使磁珠重新懸浮，將磁珠懸液轉移到新的離心管（避免原離心管壁上非特異性吸附蛋白污染目標蛋白），磁性分離，移出上清液到清洗液收集管。

6、目標蛋白洗脫

（1）用戶可根據需要改變洗脫體積調整目標蛋白濃度，加入 2~10mLElutionBuffer，輕輕翻轉離心管數次，使磁珠懸浮，磁性分離，收集洗脫液到新的離心管中，即為純化的目標蛋白樣品。

（2）如果需要，可以重復上述步驟 1 次，收集樣品到新的離心管中，以檢測目標蛋白是否洗脫wan全。

7、磁珠后處理

（1）在裝有磁珠的離心管中加入 5mLElutionBuffer，上下翻轉離心管數次，使磁珠懸浮，磁性分離， 去除上清液。

（2）重復上述步驟 2 次。

（3）在離心管中加入 5mLddH2O，上下翻轉離心管數次，使磁珠懸浮，磁性分離，去除上清液。

（4）重復上述步驟 2 次。

（5）加入 StorageBuffer 到磁珠中使總體積為 5mL，保存于 2~30℃（長期保存，置于 2~8℃），可用于下一次同種蛋白的純化。

8、磁珠再生

磁珠連續使用三次以上，其結合目標蛋白的能力可能會明顯降低，建議進行磁珠再生處理。

Stripping Buffer：20 mM SodiumPhosphate，500mMNaCl，100mMEDTA， pH7.4

BeadsWashing Buffer（可選）：0.5MNaOH，2MNaCl

Recharge Buffer：100 mMNiSO4/ CoCl2 （該化學試劑具有一定的毒性，可能造成過敏反應，使用時務必注意自身安全）

Storage Buffer：20%（v/v）乙醇

以 5mL10%（v/v）磁珠懸液為例，詳細說明磁珠再生操作：

（1）將磁珠懸液進行磁性分離，去除上清液，從磁性分離器上取下離心管，在離心管中加入 5mLddH2O， 上下翻轉離心管數次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，去除上清液。

（2）加入 5mLStrippingBuffer，上下翻轉離心管數次，使磁珠重新懸浮，室溫旋轉混合 5min，磁性分離，去除上清液。重復此步驟 1 次。

（3）加入 5mLddH2O，上下翻轉離心管數次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，去除上清液，重復

此步驟 2 次。

（4）堿處理：加入 5mLBeadsWashingBuffer，上下翻轉離心管數次，使磁珠重新懸浮，室溫旋轉混合 5min，磁性分離，去除上清液。加入 5mLddH2O，上下翻轉離心管數次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，去除上清液。重復 ddH2O 洗滌步驟 3~5 次，至洗滌液呈中性為止。

（5）加入 5mLRechargeBuffer，上下翻轉離心管數次，使磁珠重新懸浮，室溫旋轉混合 20min，磁性分離，去除上清液。

（6）加入 5mLddH2O，上下翻轉離心管數次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，去除上清液。重復此步驟 4 次以上，保證鎳離子去除wan全。

（7）加入 StorageBuffer 到磁珠中使總體積為 5mL，保存于 2~30℃ （長期保存，置于 2~8℃）

蛋白純化流程的優化

以上操作流程適用于大部分組an酸標簽蛋白的純化，根據目標蛋白與金屬離子螯合磁珠的結合性能不同， 用戶可以從以下幾個方面對純化流程進行優化，以提高目標蛋白的回收率和純度。

提高目標蛋白回收率的參考方法：

（1）降低樣品溶液和BindingBuffer 中的 Imidazole 濃度；

（2）樣品溶液和其它緩沖液中添加表面活性劑等物質；

（3）添加合適的蛋白酶抑制劑，防止目標蛋白降解；

（4）增加磁珠用量；

（5）延長蛋白與磁珠孵育的時間；

（6）延長洗脫目標蛋白的時間或增加洗脫次數。

提高目標蛋白純度的參考方法：

（1）提高樣品溶液和BindingBuffer 中 Imidazole、NaCl 的濃度；

（2）樣品和緩沖液中添加表面活性劑等物質；

（3）添加合適的蛋白酶抑制劑，防止目標蛋白降解；

（4）延長洗滌的時間，增加洗滌次數；

（5）采用梯度 Imidazole 濃度洗脫目標蛋白。

注意事項

1、shou次使用本產品前，請務必詳細閱讀本用戶手冊；

2、磁珠使用和保存過程中應避免冷凍、干燥和高速離心等操作；

3、在使用本產品前，請務必充分振蕩使磁珠保持均勻的懸浮狀態；

4、請選用質量好的移液器吸頭和離心管，以免磁珠貼壁或混合過程發生滲漏引起磁珠的損耗；

5、磁珠與溶液混合過程中，如果溶液粘稠無法通過翻轉離心管重懸磁珠，可采用移液器反復吹吸或短時漩渦混合使磁珠充分重懸；

6、用戶可根據實際需要保留經磁性分離移去的上清液，進行取樣檢測，以便分析純化過程和優化蛋白純化流程；

7、本產品可以重復使用，當純化性能降低時，建議進行再生處理；

8、使用過的磁珠重復使用時，建議純化同種蛋白，純化不同種類的蛋白時，建議使用新的磁珠；

9、本產品需與磁性分離器配套使用；

10、本產品僅供研究使用。

 His-Tag蛋白純化磁珠（鈷離子）輔助試劑

產品訂購信息

M0198 His-Tag蛋白純化磁珠（鈷離子） IDA-Cobalt  5mL/2×50mL