NobleRyder CA9418 Calcein-AM/PI活細胞/死細胞雙染試劑盒Calcein-AM/PI，Live/Dead Cell Double Stain Kit

產品貨號：CA9418

產品名稱：Calcein-AM/PI活細胞/死細胞雙染試劑盒Calcein-AM/PI，Live/Dead Cell Double Stain Kit

英文名稱：Calcein-AM/PI，Live/Dead Cell Double Stain Kit

產品規格：500T

Calcein-AM/PI活細胞/死細胞雙染試劑盒檢測

產品簡介：

儲存條件：-20℃，避光，有效期1年。

具體產品的參數以收到產品說明書的參數為準

NobleRyder CA9418 Calcein-AM/PI活細胞/死細胞雙染試劑盒Calcein-AM/PI，Live/Dead Cell Double Stain Kit是一種對活細胞進行熒光標記的細胞染色試劑，發綠色熒光（Ex=490nm,Em=515nm）。因其在傳統的Calcein（鈣黃綠素）基礎上引入yi酰甲氧基甲酯（AM）基團，增加了疏水性，使其能夠輕易穿透活細胞膜。一旦進入細胞后，Calcein-AM（本身不發熒光）被細胞內的酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子Calcein，從而被滯留在細胞內并發出強綠色熒光。與其它同類試劑（如BCECF-AM和CFDA)相比，由于Calcein,AM細胞毒性極低，是最shi合用于活細胞染色的熒光探針，而且不會抑制任何的細胞功能，如增殖和淋巴球的趨化性。

由于死細胞缺乏酯酶，Calcein-AM僅用于對活細胞的細胞生存能力測試和短期標記。因此，Calcein-AM 常常與死細胞熒光探針如碘化bing啶（PI）等聯合使用，同時進行活細胞和死細胞的熒光雙重染色。碘化bing啶（Propidiumiodide，PI）不能穿過活細胞的細胞膜，僅能穿過死細胞膜的無序區域而到達細胞核，并嵌入細胞的DNA雙螺旋從而產生紅色熒光（Ex=535nm,Em=617nm），因此PI 僅對死細胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490nm激發，因此可用熒光顯微鏡同時觀察活細胞和死細胞。而用545nm激發，僅可觀察到死細胞。

本試劑盒的工作原理就在于Calcein-AM和PI的雙重染料，來進行活細胞和死細胞的雙重染色標記，從而進行活細胞和死細胞水平的分析。根據我司優化的實驗體系，單次就100µL細胞懸液進行染色，可以做500次檢測。

使用方法（僅供參考）：

1. 工作液的前處理

(1) 從低溫冰箱內取出10×AssayBuffer，根據單次用量無菌條件取出適量，用去離子水10倍稀釋以得到1×AssayBuffer。

(2) 由于Calcein-AM 的穩定性受溫度影響較大，建議收到貨后，可分裝為小份，密封避光保存于-20℃，不能反復凍融。若染色液經稀釋，建議當天用完。

2. 細胞處理

(1) 懸浮生長的細胞，收集至離心管，450g ，離心5min，去除上清。用1x的AssayBuffer洗滌細胞，450g，離心5min，2次，去除殘留酯酶。

(2) 貼壁細胞經0.25%yi酶-EDTA消化后，收集細胞，用1x的AssayBuffer洗滌細胞，450g，離心5min，2次，去除yi酶及殘留的酯酶。

3. 染色步驟

(1) 離心得到的細胞沉淀用1×AssayBuffer重懸，使重懸后細胞懸液計數細胞量為1×105~6個/ml。

(2) 每1ml的細胞量加入1-2ul的Calcein-AM（原液），吹打混勻，37℃避光孵育 20min-25min。

(3) 將試劑盒自帶的PI原液取3-5ul加入上述染色細胞中，室溫避光染色5min。

(4) 孵育熒光后的細胞，450g，5min，離心去除染色液。

注：細胞進行熒光染色時建議全程避光。

(5) 用1x的PBS清洗細胞450g，5min，離心后用1xPBS重懸細胞，取3-5ul滴在潔凈的載玻片上，用干凈的蓋玻片壓片后，請及時熒光鏡檢。

(6)  熒光顯微鏡下使用490±10nm激發濾片同時檢測活細胞（黃綠色熒光）以及死細胞（紅色熒光）。另外，使用545nm的發射濾片僅能觀察到死細胞。也可以直接在熒光酶標儀下使用合適的濾片進行檢測。

注意事項：

(1) 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

(2) 貼壁細胞也可以不消化，直接去除培養基，經1×AssayBuffer浸洗2min，2次。按上述細胞量和染色液濃度比例進行染色，染色時間和染色液工作濃度可按實際檢測調整。

(3) Calcein-AM 作用于細胞，一般細胞量在1×105-6個時，Calcein-AM的工作濃度基本在2-4µM（如遇鏡檢熒光亮度過強，稀釋比例可適當調整在1:500到1:2000或更大）；PI的工作濃度在5µM左右。但由于不同細胞系的優良染色條件不同，初次實驗建議做梯度實驗，以確定 Calcein-AM和PI的最適濃度。梯度篩選的原則為使用最di的探針濃度得到最hao的熒光結果。

(4) 碘化丙啶（PI）有一定的致癌性，操作時一定要注意防護。若接觸到皮膚，需要立即用自來水清洗。

注：可以使用以下方法來優化得到兩種熒光染料針對不同細胞的優良工作濃度。

a) 用0.1%皂素或者0.1-0.5%地gao辛孵育細胞10min，或者用70%乙醇孵育細胞30min，從而制備死細胞；

b) 用0.1-10µM的PI溶液進行死細胞染色，以得到僅僅對細胞核染色，而不會對細胞質染色的優良工作濃度。

c) 用0.1-10µM 的Calcein-AM 進行死細胞染色，以得到不會對細胞質染色的優良工作濃度。然后用此濃度進行活細胞染色，去觀察是否活細胞能被染色。

Calcein-AM/PI活細胞/死細胞雙染試劑盒檢測 

產品訂購信息：

CA9418 Calcein-AM/PI活細胞/死細胞雙染試劑盒Calcein-AM/PI，Live/Dead Cell Double Stain Kit  500T