用于寬場顯微鏡的高速熒光壽命成像

快速的細胞過程、移動的粒子和快速的圖像采集歷來是使用單光子計數技術進行壽命成像的挑戰。寬場 FLIM 套件通過在寬場照明裝置中實現視頻速率壽命成像，解決了這些限制。該套裝將Pi Imaging的高分辨率SPAD5122 相機與PicoQuant的多功能脈沖激光器組合以及通過NovaLITE軟件進行的GPU 加速FLIM分析結合在一起。它專為兼容光片和其他寬場顯微鏡系統而設計，通過脈沖激發和時域門控檢測引入了FLIM功能。NovaLITE簡化了數據分析，針對 TIFF 文件格式進行了優化，確保了高效、準確的處理。

特點：

• 使用512x512像素時間門控SPAD相機進行寬場壽命成像

• 比共焦FLIM快達100倍

• 結合落射熒光和光片顯微鏡進行測試

• 激光選項適用于各種應用

• 易于使用的基于GPU的分析軟件NovaLITE

應用：

FLIM寬場顯微鏡的應用

下面，我們將重點介紹我們的寬視場FLIM套裝所擅長的兩個關鍵應用： 光片FLIM和寬場FLIM。從二維寬場顯微鏡到使用光片技術對活體樣本進行三維成像，每一種應用都展示了寬場FLIM套件在為高級生物研究提供高速、高精度成像方面的多功能性。

光片FLIM

在光片顯微鏡（或選擇性平面照明顯微鏡，SPIM）中，樣品的一個平面被光片照射，光片通常由圓柱透鏡或來回掃描的光束產生。被照亮的平面隨后通過相機成像。光片顯微鏡因其快速、柔和和三維功能，非常適合對大型活體樣本進行研究。壽命成像提供的傳感或同步多路復用與這些優勢相輔相成，使光片 FLIM 成為一種非常有效的組合。

我們與法國艾克斯-馬賽大學（Aix-Marseille Université）的研究人員合作，擴展了一種光片顯微鏡，以實現光片FLIM。該顯微鏡是一種專門的單物鏡光片，針對有機體的高通量成像進行了優化。我們將該顯微鏡與用于脈沖照明的光纖耦合VisUV488和SPAD5122傳感器（高速版本）相結合，在類器官樣品上進行FLIM。

圖中顯示了光片 FLIM 如何用于同步多路復用。我們對小鼠胚胎干細胞生成的活體器官進行了成像。細胞核表達 H2B-GFP，細胞膜用 Flipper-TR 染色。

下面的視頻顯示的是有機體的三維成像，通過生命周期進行多路復用。對于該數據集，光片由來回掃描的高斯光束產生（488nm波長下的平均功率約為70µW），每個Z平面的采集時間為1.1s。刻度線為50µm。

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有關其他結果，包括不同光片模式與共焦 FLIM 的比較以及活體有機體的三維張力圖譜，請查閱 bioRxiv 上的預印本。

寬場 FLIM

在落射熒光寬場顯微鏡中，樣品的一個區域被準直激光束照射。然后將激發的熒光成像到相機上。為了進行寬場熒光成像，我們擴展了一臺落射熒光顯微鏡（Olympus IX73），配備了用于照明的光纖耦合高功率530nm激光器（LDH P-FA-530XL）和高速版 SPAD5122傳感器。

圖片顯示的是商用固定細胞樣本（Gattaquant，比例尺為5µm）的寬視場 FLIM 和共聚焦FLIM。線粒體和微管蛋白用光譜重疊的染料標記，但可通過壽命區分開來。即使在寬場 FLIM 上進行 40ms的采集，也能看到這種壽命對比。圖中顯示了隨著成像速度的增加，壽命直方圖的范圍也在擴大。采集時間為300ms的寬場圖像和采集時間為 5s的共聚焦圖像的壽命直方圖都是雙峰的。不過，共焦圖像中的生命周期分隔更大。這并不是門控采集的偽影，而是落射熒光顯微鏡缺乏切片的結果，在這種情況下，焦內和焦外的壽命是混合的。寬視場 FLIM 圖像是在激光輸出平均功率約為10mW 的情況下記錄的，相當于視場中約50W/cm2。

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寬場FLIM的高速性尤其有利于在對移動樣品成像時避免運動模糊。視頻顯示了大型熒光珠在水中自由漂浮的實時畫面（比例尺10µm）。溶液中含有兩種不同類型的珠子，它們具有相似的光譜特性，但壽命不同。在視頻中，以每秒23幀的幀頻，可以根據熒光珠的壽命清楚地分辨出兩種類型的熒光珠。

相關套件：

寬視場FLIM組件

照明選項

根據照明模式（如 Epi、TIRF、光片......）和樣品的不同，寬場 FLIM 應用對照明光源的要求也大相徑庭。在目前測試的應用中，所需的平均激光功率從數字掃描光片系統中的約 100 µW 到落射熒光寬場顯微鏡中的 25 mW 不等。我們將幫助您從 PicoQuant 大量的脈沖激光源組合中選擇適合您應用的選項。

標準光源：

• LDH系列：皮秒半導體激光頭

• Prima3色增益開關皮秒激光器

高功率光源：

• VisUV：紫外、綠光、黃光和橙光皮秒激光器

• LDH-FA 系列：放大型皮秒脈沖半導體激光頭

探測器

探測器是Pi Imaging公司的SPAD5122 SPAD圖像傳感器，像素為512x512。該傳感器可通過納秒級的全局曝光進行時間分辨檢測，并能以皮秒級的精度相對于激光脈沖進行移動。該傳感器采用微透鏡，提高了填充因子，整體計數率高達15Gcps。

*通常情況下，套件默認包括標準版本，如需高速版本，請提前問詢。

軟件

分析軟件 NovaLITE 讀取單個門控衰減測量值，并進行平均壽命、相位和擬合分析。用戶可以直觀地將壽命顯示為直方圖或相位圖。通過 GPU 加速擬合，可在數秒內根據固定壽命擬合單次或多次指數衰減和物種分離。結果可導出為 TIFF 格式，以便進一步處理。請注意，NovaLITE 是一款純粹的分析軟件，數據采集由 SPAD5122 軟件處理，用戶可通過遠程接口將其集成到顯微鏡中。PicoQuant 的分析軟件使用通用的 TIFF 文件格式。這不是 SPAD5122 采集軟件的默認格式，文件需要轉換。

請聯系我們，配置適合您需要的套件 。

套裝包含：

• 一個或多個激光器，用于所需波長的脈沖照明

• 512x512 像素 SPAD 陣列探測器（PI Imaging 公司的 SPAD5122高速單光子相機）

• 用于執行快速 FLIM、擬合和相位分析的分析軟件

• 技術和應用驅動遠程支持

使用陣列探測器的門控FLIM原理

在共聚焦 FLIM 中，通過掃描像素來依次獲取壽命圖像。每個像素中的壽命信息與 TCSPC 檢測并行獲取，從而構建壽命直方圖。相比之下，在門控 FLIM 中，整個圖像是并行采集的。然而，壽命信息是通過相對于熒光壽命衰減移動門來依次獲取的。時間分辨率是通過丟棄落在門外的光子生成的。因此，成像速度、時間分辨率甚至總探測效率都取決于采集參數，其方式比共焦熒光成像技術更為復雜。