高級磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）分析原理：
磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）檢測試劑盒用于測量在 Thr202/Tyr204 位點磷酸化的 ERK。與蛋白質(zhì)印跡法不同，該檢測基于微孔板，不需要凝膠、電泳或轉(zhuǎn)膜。磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）檢測使用兩種標(biāo)記抗體：一種帶有供體熒光團(tuán)，另一種帶有受體。第一種抗體因其對蛋白質(zhì)上磷酸化基序的特異性結(jié)合而被選擇，第二種抗體因其能夠識別不依賴于其磷酸化狀態(tài)的蛋白質(zhì)的能力而被選擇。蛋白質(zhì)磷酸化使得涉及兩種標(biāo)記抗體的免疫復(fù)合物形成，并使供體熒光團(tuán)靠近受體，從而產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）信號。其強度與樣品中磷酸化蛋白的濃度直接成正比，并提供了一種在無需洗滌的檢測形式下評估蛋白質(zhì)磷酸化狀態(tài)的方法。

高級磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）雙板檢測方案：
雙板方案涉及在 96 孔板中培養(yǎng)細(xì)胞，然后裂解，再將裂解液轉(zhuǎn)移到 384 孔低體積檢測板中，然后加入磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）HTRF 檢測試劑。該方案能夠監(jiān)測細(xì)胞的活力和融合度。

高級磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）單板檢測方案：
使用 HTRF 試劑檢測磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）可以在用于培養(yǎng)、刺激和裂解的單板上進(jìn)行。無需洗滌步驟。這種為高通量篩選設(shè)計的方案能夠?qū)崿F(xiàn)微型化，同時保持穩(wěn)健的 HTRF 質(zhì)量。

分析驗證：

與蛋白質(zhì)印跡法相比，高級磷酸化 ERK 具有靈敏度。

在 HEK293 細(xì)胞培養(yǎng) 48 小時后，用 50nM EGF 刺激 5 分鐘。去除培養(yǎng)基并裂解后，收集細(xì)胞裂解液并離心 10 分鐘。進(jìn)行系列稀釋，并通過蛋白質(zhì)印跡法和 HTRF 高級磷酸化 ERK 并行分析。使用 HTRF 高級磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）時，僅需 300 個細(xì)胞即可檢測到最小信號，而蛋白質(zhì)印跡法則需要 10,000 個細(xì)胞才能產(chǎn)生信號。HTRF 高級磷酸化 ERK 檢測至少比蛋白質(zhì)印跡法靈敏 30 倍，并且顯示出最佳的相關(guān)性。

無需刺激即可對抑制劑的基礎(chǔ)磷酸化 ERK 進(jìn)行劑量反應(yīng)。

高級磷酸化 ERK 能夠研究 MAPK 通路抑制劑化合物在基礎(chǔ)激活水平上的作用，無需通路刺激。由于其高交叉反應(yīng)性，高級磷酸化 ERK 與許多不同的模型物種高度兼容：人、小鼠、大鼠、狗、猴、倉鼠、貂、牛、豬、果蠅和斑馬魚。所有實驗均使用貼壁細(xì)胞的雙板檢測方案進(jìn)行。接種一天后，所有細(xì)胞系在 37°C、5% CO?下用相應(yīng)的抑制劑處理 30 分鐘。

磷酸化 ERK 在糖尿病模型和患者血細(xì)胞中的調(diào)節(jié)

高級磷酸化 ERK 檢測試劑盒非常適合監(jiān)測胰腺 β 細(xì)胞系或患者外周血單個核細(xì)胞（PBMC）中的激動劑刺激。實驗在兩種胰腺 β 細(xì)胞系 Ins-1E 和 Min6 上進(jìn)行。使用雙板檢測方案。兩種細(xì)胞系均以 70,000 個細(xì)胞 / 孔的密度接種 4 天。細(xì)胞洗滌后，用不含葡萄糖的 Krebs Ringer 緩沖液孵育。饑餓 2 小時后，用葡萄糖刺激細(xì)胞。將 PBMC 以 100,000 個細(xì)胞 / 孔的密度分配，然后在 37°C、5% CO?下用佛波酯（PMA）刺激 30 分鐘。

腫瘤異種移植中靈敏的磷酸化 ERK 檢測。

從裸鼠中切除 BxPC-3 胰腺腫瘤異種移植組織，研磨并裂解。離心后，收集可溶性部分并進(jìn)行系列稀釋，然后用 HTRF 高級磷酸化 ERK 試劑盒試劑進(jìn)行檢測。

優(yōu)化用于磷酸化 ERK 檢測的細(xì)胞密度。

由于高級磷酸化 ERK 的高靈敏度，當(dāng)預(yù)期 ERK 磷酸化水平較高時，建議使用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系的低細(xì)胞密度，以確保在試劑盒的線性范圍內(nèi)操作并實現(xiàn)最佳的信號 / 背景比（S/B）。使用貼壁細(xì)胞的雙板檢測方案，在 HEK293 細(xì)胞上用 EGFR 激動劑 EGF 或小分子 Raf 激酶抑制劑 L779 - 450 進(jìn)行劑量反應(yīng)實驗。細(xì)胞以 25,000、50,000 或 100,000 個細(xì)胞 / 孔的密度在 37°C、5% CO?下接種 24 小時。

Gαq/i 偶聯(lián)受體激活。

使用磷酸化 ERK 細(xì)胞檢測的雙板檢測方案，在 CHO - CCR5（25,000 個細(xì)胞）上用 Rantes 和 MIP - I? 激活 10 分鐘獲得的結(jié)果。

篩選魯棒性。

在室溫下用卡巴刺激 CHO - M1（5,000 個細(xì)胞 / 孔 - 384 孔小體積板）10 分鐘。在五十次重復(fù)實驗中，計算未刺激細(xì)胞（基礎(chǔ)水平）和兩個選定的卡巴濃度（1.3μM 和 4μM，分別對應(yīng)于 EC80 和 EC100）之間的 Z' 值。使用磷酸化 ERK 試劑盒的單板檢測方案在來自 CyBio™的機器人系統(tǒng)（配備 384/25μL 移液頭的 CyBivario）上進(jìn)行檢測。結(jié)果在 PHERAStar Plus（BMG Labtech）上讀取。

總 ERK1/2 檢測以控制 ERK1/2 的磷酸化。

使用磷酸化 ERK1/2 和總 ERK1/2 檢測的雙板檢測方案，用 EGF 激活 A431 細(xì)胞（100,000 個細(xì)胞 / 孔）10 分鐘。正如預(yù)期的那樣，結(jié)果顯示在 EGF 刺激下 ERK1/2 磷酸化呈劑量反應(yīng)性增加，而 ERK1/2 表達(dá)水平保持恒定。

簡化的通路：

MAPK/ERK 細(xì)胞信號通路：

MAPK/ERK 信號級聯(lián)由參與生長和分化的多種受體激活。核心信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)引發(fā)眾多細(xì)胞過程的調(diào)節(jié)，包括粘附、遷移、凋亡、分化和代謝。MEK1/2 在 Tyr204 和 Thr202 位點催化 ERK1/2 的磷酸化。作為響應(yīng)，ERK 磷酸化數(shù)百種細(xì)胞質(zhì)和核底物。MAPK 信號的廣泛復(fù)雜性和多樣性使 ERK 成為生物學(xué)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子和主要信號節(jié)點。

ERK 在 GPCR 信號通路中的作用：
ERK 調(diào)節(jié)在 GPCR 信號通路中起著重要作用，因此是一個重要的可測量的 GPCR 讀出指標(biāo)。GPCR 通過 G 蛋白作用調(diào)節(jié)廣泛的細(xì)胞功能。在刺激下，這些受體激活效應(yīng)器如腺苷酸環(huán)化酶和磷脂酶 C，這不僅影響細(xì)胞內(nèi)第二信使如 cAMP 和 Ca2?的濃度，還介導(dǎo) ERK1/2 磷酸化。GPCR 也已被證明以不依賴 G 蛋白但依賴 β-arrestin 的方式介導(dǎo) ERK1/2 激活。