實時熒光定量PCR實驗服務

【星森林生物】提供快捷高效的實時熒光定量PCR(Real Time PCR,RT PCR)服務，所謂實時熒光定量PCR技術，是指在PCR 反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。 是一個常用的mRNA水平的基因表達定量技術。

服務內容

細胞/組織的基因差異表達檢測，經過不同處理樣本之間特定基因的表達差異(如藥物處理、物理處理、化學處理等)，特定基 因在不同時段的表達差異以及cDNA芯片或差顯結果的確證。

 組織/細胞樣品中基因拷貝數的確定，DNA或RNA的相對和絕dui定量分析。

包括病原微生物或病毒含量的檢測，轉基因動植 物轉基因拷貝數的檢測，RNAi基因失活率的檢測等。

基因分型，基因突變及多態性方面的研究。

技術原理

Real-time PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線 對未知模板進行定量分析的方法。利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化，通過Ct值和 標準曲線的分析對起始模板進行定量分析。

實時熒光定量PCR技術具有特異性強，有效解決了PCR污染問題、自動化程度高等特點，做到PCR每循環一次就收集一個 數據，建立實時擴增曲線，準確地確定Ct值，從而根據Ct值確定起始DNA拷貝數，做到了真正意義上的DNA定量。

技術流程

一、RNA的提取

二、DNase I 消化樣品RNA 中的DNA

三、RNA瓊脂糖凝膠電泳

四、RNA反轉錄為cDNA Real-Time PCR引物設計的要求

① Tm=55~65 ℃

② GC=30~80%

③ PCR擴增產物長度：引物的產物大小不要太大，一般在80~300 bp之間都可。 ④ 引物的退火溫度要高，一般要在60 ℃以上。

五、cDNA與引物質量檢測

選擇特異性好，擴增效率高的引物作為實時熒光使用引物。

六、利用相對定量的方法分析目的基因表達量的情況：

常用的看家基因有β-actin，GAPDH，18S rRNA

七、定量PCR檢測

八、擴增曲線和溶解曲線

溶解曲線全部為單峰表明為特異性擴增，熒光擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數擴增階段和平 臺期。

歡迎咨詢詳談，我們會根據您的方案及需求制定詳細的服務協議。

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