PANC-1/GEM 人胰腺癌細(xì)胞吉西他濱耐藥株 百歐博偉生物

PANC-1/GEM 人胰腺癌細(xì)胞吉西他濱耐藥株 百歐博偉生物

一、細(xì)胞簡(jiǎn)介

平臺(tái)編號(hào)：bio-106238

規(guī)格：1*10E6

拉丁屬名：PANC-1/GEM 人胰腺癌細(xì)胞吉西他濱耐藥株

中文名稱(chēng)：人胰腺癌細(xì)胞吉西他濱耐藥株

細(xì)胞用途：僅供科研使用

注意事項(xiàng)：僅用于科學(xué)研究或者工業(yè)應(yīng)用等非醫(yī)療目的，不可用于人類(lèi)或動(dòng)物的臨床診斷或治療，非藥用，非食用

二、細(xì)胞描述

該人胰腺癌細(xì)胞PANC-1來(lái)源于一名56歲白人男性。1 U/ml 左旋天冬酰胺酶(L-asparaginase)可抑制其生長(zhǎng)。此細(xì)胞可以在瓊脂糖上生長(zhǎng)。

三、細(xì)胞特性

1）來(lái)源：胰腺，胰管，上皮細(xì)胞癌

2）形態(tài)：上皮細(xì)胞樣，貼壁生長(zhǎng)

3）含量：>1x106

4）污染：支原體、細(xì)菌、酵母和真菌檢測(cè)為陰性

5）規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

四、細(xì)胞誘導(dǎo)構(gòu)建實(shí)驗(yàn)步驟

1、MTT 法檢測(cè) PANC-1 對(duì)吉西他濱的 IC50將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 PANC-1 細(xì)胞傳代后，以 6000/孔的密度接種在 96 孔板里，待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后，將培養(yǎng)基更換為含不同濃度吉西他濱的培養(yǎng)基，濃度依次為 0.03μg/mL、0.3μg/mL、1.5μg/mL、3μg/mL、6μg/mL、12μg/mL、18μg/mL。置于含 5%CO2、飽和濕度的 37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 72h。取出 96孔板，每孔加入 20ul MTT（5 mg/mL）溶液加入到每個(gè)培養(yǎng)孔中，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。4 h 后，取出 96 孔板，吸除培養(yǎng)基，排槍每孔加入 150 µL Formazan 溶液，置搖床上低速振蕩 10-30min，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶標(biāo)儀在 OD 570nm 處測(cè)量各孔的吸光值，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出 IC50 為 0.9μg/mL，則選擇此濃度作為 PANC-1耐藥株誘導(dǎo)的起始濃度。

2、PANC-1 細(xì)胞耐藥分步誘導(dǎo)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 PANC-1 細(xì)胞，加入含 0.9μg/mL 吉西他濱的培養(yǎng)基，置于含 5%CO2、飽和濕度的 37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔日換液（同濃度含藥培養(yǎng)基），待細(xì)胞可以穩(wěn)定生長(zhǎng)后加大藥物濃度，每次增加 2 倍，直至 10 個(gè)月后，細(xì)胞可以在含 18μg/mL 吉西他濱的培養(yǎng)基保持穩(wěn)定生長(zhǎng) 4day，視為細(xì)胞耐藥成功，并命名為 PANC-1/GEM。

五、細(xì)胞的運(yùn)輸和保存

可選擇干冰運(yùn)輸及發(fā)送復(fù)蘇存活細(xì)胞方式

（1）干冰運(yùn)輸，收到后立即轉(zhuǎn)入液氮凍存或直接復(fù)蘇；

（2）存活細(xì)胞，收到后應(yīng)繼續(xù)生長(zhǎng)，傳代達(dá)到細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，再進(jìn)行凍存。具體操作見(jiàn)細(xì)胞培養(yǎng)步驟。

六、注意事項(xiàng)

1、收到細(xì)胞后，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請(qǐng)立即與我們聯(lián)系。

2、收到細(xì)胞先不開(kāi)瓶蓋，瓶身擦拭酒精后放在培養(yǎng)箱靜置2-4小時(shí)（視細(xì)胞密度而定）穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。接著在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照（建議收細(xì)胞時(shí)就整體外觀拍一張照片，觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況，隨后在顯微鏡下拍下細(xì)胞狀態(tài)，100*，200*各一張），觀察記錄細(xì)胞在運(yùn)輸過(guò)程中是否有污染情況。作為我方進(jìn)行銷(xiāo)售依據(jù)。

3、由于細(xì)胞狀態(tài)受環(huán)境、操作和運(yùn)輸?shù)榷喾矫嬉蛩赜绊?，故本公司只保證客戶(hù)收到細(xì)胞后一周內(nèi)的細(xì)胞狀態(tài)，故客戶(hù)需要售后時(shí)需出示收到細(xì)胞的時(shí)間證明及客戶(hù)提供收貨時(shí)間和發(fā)現(xiàn)問(wèn)題后客服人員溝通的時(shí)間證明，期間間隔時(shí)間不能大于7天。

4、所有動(dòng)物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級(jí)生物安全臺(tái)內(nèi)操作，并請(qǐng)注意防護(hù)，所有廢液及接觸過(guò)此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

七、細(xì)胞接收后的處理方法

1）收到細(xì)胞后，請(qǐng)檢查發(fā)貨培養(yǎng)瓶的狀況，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細(xì)胞有污染，請(qǐng)拍照后及時(shí)聯(lián)系我們。

2）在顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)時(shí)，在低倍鏡（4或5X物鏡)下進(jìn)行，能準(zhǔn)確判斷細(xì)胞的傳代密度。看細(xì)胞的形態(tài)請(qǐng)?jiān)?0X和20×物鏡下，同時(shí)給剛收到的細(xì)胞拍照，（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為細(xì)胞需要售后時(shí)提供收到細(xì)胞時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。

3）觀察好細(xì)胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h。

4）貼壁細(xì)胞：在運(yùn)輸過(guò)程中貼壁細(xì)胞會(huì)有脫落的現(xiàn)象，如發(fā)現(xiàn)貼壁細(xì)胞有脫落或者脫落后抱團(tuán)生長(zhǎng)，可將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，然后抽出瓶中的培養(yǎng)基和未貼壁細(xì)胞1000rpm離心5分鐘，棄去上清重懸后接種到加有按照說(shuō)明書(shū)細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的培養(yǎng)基的原培養(yǎng)瓶中（或新的培養(yǎng)瓶中）。

5）懸浮細(xì)胞：T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，然后抽出瓶中的培養(yǎng)基和細(xì)胞1000rpm離心5分鐘，棄去上清重懸后接種到新的培養(yǎng)瓶中（加入按照說(shuō)明書(shū)細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的培養(yǎng)基）。

6）備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞，請(qǐng)換用按照說(shuō)明書(shū)細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。收到細(xì)胞后次傳代建議1：2傳代。                 

八、細(xì)胞培養(yǎng)步驟

1、培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1）準(zhǔn)備DMEM培養(yǎng)基（含NaHCO3 1.5g/L；GIBCO,貨號(hào)12800017，添加NaHCO3 1.5g/L)；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；L-glutamine(推薦gibco貨號(hào)：35050-061)，2mM；雙抗，1%；（可在培養(yǎng)基中加入耐藥濃度18ug/ml的GEM)

2）細(xì)胞在傳代和剛復(fù)蘇時(shí)較為脆弱，中止液須為不含GEM的培養(yǎng)基，且在細(xì)胞未貼壁期間和貼壁前期需用不含GEM的培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定時(shí)再根據(jù)需要濃度添加 GEM。

3）若細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較為緩慢時(shí)，可適當(dāng)降低GEM的濃度，或使用不含GEM的培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較好時(shí)，再更換為所需的GEM濃度。

4）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

5）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2、細(xì)胞處理：

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

①棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

②加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

③按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

④將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后加入少量，細(xì)胞變圓脫落后，加入約1ml含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中，再添加10%DMSO后進(jìn)行凍存。

下面T25瓶為例；

1、細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml，細(xì)胞變圓脫落后，加入2ml培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

2、1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。本公司按每個(gè)凍存管細(xì)胞數(shù)目大于1X106個(gè)細(xì)胞凍存。

3、將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。