產品信息

其他自備材料和試劑

MG&ABW基質膠

組織消化液

上皮類器官基礎培養基

類器官消化液

小鼠肝膽管(擴增)類器官培養基

類器官冷凍保存培養基(無血清)  

DPBS (1X)，液體，不含鈣和鎂  

FBS（胎牛血清）

EDTA

小鼠肝膽管類器官擴增培養基和穩態培養基的制備

采用無菌技術制備小鼠肝膽管類器官擴增培養基和穩態培養基。在小鼠肝膽管類器官擴增培養基中生長的小鼠肝膽管類器官絕大多數是肝膽管細胞。

以下是準備 10mL培養基的示例，如所需量不同，可相應調整用量。

1.冰上解凍小鼠肝膽管類器官培養因子B、小鼠肝膽管類器官培養因子C。

注意： 解凍后，建議將小鼠肝膽管類器官培養因子B、小鼠肝膽管類器官培養因子C分別分裝后保存取用，避免反復凍融。

2. 配制小鼠肝膽管類器官擴增培養基，專門用于原代培養和復蘇。添加200 μL小鼠肝膽管類器官培養因子B (50x)、40 μL小鼠肝膽管類器官培養因子C (250x)至9.76 mL小鼠肝膽管類器官基礎培養基中，混合均勻。

注意：配制后的小鼠肝膽管類器官培養基可在 2-8°C 儲存，建議在兩周內使用。小鼠肝膽管類器官培養因子B(50x)內含有細菌及真菌抗生素(50x)。

小鼠肝膽管(分化)類器官的培養

小鼠肝膽管類器官原代培養

從初級組織中建立類器官

1. 使用離心管將原代小鼠肝膽管組織收集在冰冷的原代組織儲存液中，將組織樣本保存在4°C，直到開始分離。

2. 評估獲得的組織碎片是否由上皮組織組成。如果存在脂肪或肌肉組織，請在解剖顯微鏡下使用手術剪刀或手術刀和鑷子盡可能多地去除這些非上皮成分。如果沒有脂肪或肌肉組織，請立即繼續下一步。

3.用上皮類器官基礎培養基或DPBS沖洗肝肝膽管組織，直到上清澄清。

4. 在腺窩結構分離之前，將基質膠解凍并保持低溫。加入5 mL FBS至45 mL上皮類器官基礎培養基中制備10%FBS培養基。

5. 將組織在細胞培養皿中使用外科剪刀或手術刀切成5mm³的小碎片。

6.將分離的樣品放入一個15毫升的離心管中，管中含有10ml預冷的DPBS。

7.用10ml移液管清洗樣品至少10次。

注：在接下來的步驟中，使用10%FBS培養基潤洗10ml移液管的內表面以避免樣品粘在移液管壁上。

8.讓管子靜止不動，直到樣品沉淀到底部。用10ml移液管吸出上清液，加入10mL預冷DPBS。

9. 重復步驟7和8 3-5次，直到上清清澈。

注：清洗樣品是避免細菌污染的關鍵。

10. 向試管中加入10ml預冷DPBS，并加入2.5 mM EDTA 。把管子放在搖床上，在4°C的溫度下輕輕搖動40分鐘。

11. 用EDTA處理后，保持試管靜止，直到樣品沉淀到試管底部，然后用10ml移液管取上清液，加入10ml預冷DPBS。

12. 讓管子靜止不動，直到樣品沉淀到底部。用10ml移液管吸出上清。

13. 加入10ml預冷DPBS，用10ml移液管上下吹吸至少10次。隱窩結構會通過移液吸頭釋放到上清液中。將含有分離的隱窩的上清液放入新的15ml管中。

14. 加入10ml預冷DPBS，用10ml移液管上下吹吸至少10次。允許組織碎片在正常重力下下沉至少30秒鐘。隱窩被通過移液釋放到上清液中。將含有分離的隱窩的上清液放入一個新的15ml管中。

15. 在4℃、400g條件下離心3分鐘。吸出并丟棄上清。

16. 將沉淀重懸在1ml DPBS中，并將隱窩懸浮液轉移到新的1.5 mL管中。滴20 μL隱窩重懸液到培養皿中。在立體顯微鏡下計數隱窩的數量并計算隱窩的總數。

17. 在4℃、400g條件下離心3分鐘。吸出并丟棄上清。

18. 吸取上清，將沉淀重懸于基質膠中。基質膠應保存在冰上以防止固化。推薦重懸密度為每 25 μL基質膠懸液包含 100 - 500 個隱窩，重懸后置于冰上，重懸時間不超過 30 s 以避免基質膠過早凝固。

注意：基質膠稀釋比例應在 70%以上以保證培養過程中基質膠的結構穩定性。

19. 將基質膠和組織細胞小心均勻混合以防止氣泡產生并將懸液加入 24 孔板，30 μL每孔滴加在孔底中心，避免

懸液接觸孔板側壁。

注意：為防止基質膠室溫凝固，此步驟應盡快完成。

20. 將接種完成后的培養板置于 37℃二氧化碳恒溫培養箱中，孵育 15 -25min 左右待基質膠凝固后取出。

21. 每孔沿孔壁加入 500 μL 提前預熱的小鼠肝肝膽管類器官擴增培養基，再向 24 孔板最外周孔中每孔加入 500 μL 無菌水， 置于 37℃溫箱、5% CO2條件下培養。

注意：請沿孔壁緩慢加入，避免破壞已凝固結構。

22. 每 3 d 更換一次培養基，從孔中小心地吸出培養基，并用新鮮的、預熱過的有機培養基替換，更換培養基時應避免破壞基質膠。

23. 密切監測類器官生長狀態，理想情況下小鼠肝膽管類器官應在 5 - 8 天內建成。

小鼠肝膽管類器官傳代培養

1. 用經過潤洗液潤洗的槍頭吹打刮取類器官，并將類器官和培養基的懸液轉移至經 過潤洗液潤洗的 1.5mL EP 管中。

2. 用經過潤洗液潤洗的槍頭用力重懸類器官懸浮液，使得類器官與基質膠分離。

3.200g 離心力室溫離心 3min。

4.棄上清，使用類器官消化液或用機械破壞。對于使用類器官消化液的細胞解離，在類器官消化液中重懸類器官懸浮液，移液器反復上下吹打并置于37°C孵育，直至類器官解離。使用帶濾芯移液頭每2分鐘反復上下吹吸8次，以幫助破壞類器官。密切監視消化過程使在類器官解離液中的孵育時間最短。如發生機械故障，在1.5 mL上皮類器官基礎培養基中重懸類器官懸液。小心地用移液管吸取類器官懸浮液，反復上下30次，這將有助于消化。

警告:不要在類器官消化液中解離超過3分鐘，因為這可能會導致較差的類器官的生長甚至破壞。根據經驗，如果是小塊細胞的混合物，可以觀察到由10-50個細胞組成的細胞團，消化就完成了。

5. 消化完成后，用1ml上皮類器官基礎培養基進行一次沖洗，然后室溫下200g離心3分鐘。

6. 棄上清，用適量的基質膠重懸類器官沉淀，重懸后置于冰上，重懸時間不超過 30s 以避免基質膠過早凝固。

注意：基質膠稀釋比例應在 70%以上以保證培養過程中基質膠的結構穩定性。

7. 將基質膠和類器官的混合懸液點入 24 孔板底部正中央，避免懸液接觸孔板側壁，每孔 30uL 左右。

注意：為防止基質膠室溫凝固，此步驟應盡快完成。

8. 將接種完成后的培養板至于 37℃二氧化碳恒溫培養箱中，孵育 15min 左右待基質膠凝固。

9. 配制小鼠肝膽管類器官穩態培養基，并在37°C預熱。

10. 待基質膠凝固后，加入已預熱的小鼠肝膽管類器官培養基，24 孔板每孔 500uL。

11. 將 24 孔板置于 37℃二氧化碳培養箱中培養，直到類器官需要進一步的實驗。