產品信息

其他自備材料和試劑

MG&ABW基質膠

腫瘤組織消化液

紅細胞裂解液

類器官消化液

類器官冷凍保存培養基(無血清)  

DPBS (1X)，液體，不含鈣和鎂  

FBS（胎牛血清）

肺腺癌類器官Complete medium培養基的制備

使用無菌操作技術配制肺腺癌類器官Complete medium培養基。以下是準備 10mL Complete medium培養基的示例，如所需量不同，可相應調整用量。

1. 冰上解凍肺腺癌類器官培養因子B (50x)和肺腺癌類器官培養因子C(250x)。

注意： 解凍后，建議將肺腺癌類器官培養因子B (50x)和肺腺癌類器官培養因子C(250x)分別分裝后保存取用，避免反復凍融。

2. 將 200uL肺腺癌類器官培養因子B (50x)，40uL 肺腺癌類器官培養因子C(250x) 加至9.76mL肺腺癌類器官培養基礎培養基中，充分混合，配制成 10mL肺腺癌類器官Complete medium培養基。

注意：配制后的肺腺癌類器官Complete medium培養基可在 2-8°C 儲存，建議在兩周內使用。肺腺癌類器官培養因子B(50x)內含有細菌及真菌抗生素(50x)。

患者來源的肺腺癌類器官的原代培養

注意：涉及主要人體組織材料的研究必須遵循所有相關的機構和政府法規。在收集主要人體組織材料之前，必須獲得所有受試者的知情同意。

從初級組織中建立類器官

1.用離心管將原發性人肺腺癌組織碎片收集在冰冷的原發組織儲存溶液中。將組織樣品保持在4°C，直到分離開始。

2.評估獲得的組織碎片是否Complete medium由上皮組成。 如果存在脂肪或肌肉組織，請在解剖顯微鏡下使用手術剪刀或手術刀和鑷子盡可能多地去除這些非上皮成分。如果沒有脂肪或肌肉組織，請立即繼續下一步。

3.用肺腺癌類器官基礎培養基或DPBS沖洗組織兩次。

4.使用手術剪刀或手術刀將組織切碎成1-3mm³的小碎片，置于細胞培養皿中。

5.在37°C下用10mL腫瘤組織消化溶液在15mL離心管中消化組織片段，消化時間可變，從30分鐘到1.5小時不等。仔細監測消化過程，可適當吹打取上清觀察消化程度。當大多數組織片段能夠通過1mL移液器吸頭時，消化過程即完成。

6.將FBS加入組織消化混合物中，最終濃度為2%，并使用100μm細胞過濾器過濾。

7.收集并在4°C下以250g離心過濾的細胞3分鐘。  在可見的紅色沉淀的情況下，吸入上清液，并使用2mL紅細胞裂解液重懸沉淀，在室溫下裂解紅細胞1分鐘，并在4°C下以250g離心3分鐘。

8.吸出上清液并將沉淀重懸于基礎培養基中，在4°C下以250g離心3分鐘，再次重復此步驟。

9.吸出上清液并將沉淀重懸于基質膠中。基質膠應保存在冰上以防止其凝固。盡快進行該過程。使用的基質膠的量取決于顆粒的大小。大約10，000個細胞應接種在25 μ L基質膠中。

10.關鍵：不要過度稀釋基質膠（基質膠應>70%（基質膠體積/總體積）），因為這可能會抑制固體液滴的正確形成。

將含有類器官的基質膠鋪在24孔細胞培養板的底部，每個液滴圍繞孔中心約30 μ L。

關鍵：一旦類器官重懸于基質膠中，盡快進行種板，因為基質膠可能會在試管或移液器吸頭中凝固。不要讓基質顆粒接觸管壁。

11.將培養板放入37°C和5%CO ₂的培養箱中15-25分鐘，讓基質凝膠固化。

12.準備所需量的肺腺癌類器官Complete medium培養基。

13.一旦基質膠滴凝固（15-25分鐘），打開板并小心地向每個孔中加入500 μ L肺腺癌類器官Complete medium培養基。

關鍵：不要將培養基直接添加到基質膠液滴的頂部，因為這可能會破壞已凝固結構。

14.將培養板置于37°C和5%CO ₂的恒溫培養箱中。

15.每隔3-4天更換一次培養基，小心地從孔中吸出培養基，并用新鮮的預熱的類器官Complete medium培養基代替它。

16.密切監測類器官生長狀態，理想情況下，肺腺癌類器官應在 7 至 10 天內建成。

肺腺癌類器官的傳代培養

1. 用經過潤洗液潤洗的槍頭吹打刮取類器官，并將類器官和培養基的懸液轉移至經 過潤洗液潤洗的 1.5mL EP 管中。

2. 用經過潤洗液潤洗的槍頭用力重懸類器官懸浮液，使得類器官與基質膠分離。

3.250g 離心力室溫離心 3min。

4.棄上清，使用類器官消化液或用機械破壞。對于使用類器官消化液的細胞解離，在類器官消化液中重懸類器官懸浮液，移液器反復上下吹打并置于37°C孵育，直至類器官解離。使用帶濾芯移液頭每2分鐘反復上下吹吸8次，以幫助破壞類器官。密切監視消化過程使在類器官解離液中的孵育時間最短。如發生機械故障，在1.5 mL上皮類器官基礎培養基中重懸類器官懸液。小心地用移液管吸取類器官懸浮液，反復上下30次，這將有助于消化。

警告:不要在類器官解離液中解離超過7分鐘，因為這可能會導致較差的類器官的生長甚至破壞。根據經驗，如果是小塊細胞的混合物，可以觀察到由10-50個細胞組成的細胞團，消化就完成了。

5. 消化完成后，用1ml上皮類器官基礎培養基進行一次沖洗，然后室溫下250g離心3分鐘。

6. 棄上清，用適量的基質膠重懸類器官沉淀，重懸后置于冰上，重懸時間不超過 30s 以避免基質膠過早凝固。

注意：基質膠稀釋比例應在 70%以上以保證培養過程中基質膠的結構穩定性。

7. 將基質膠和類器官的混合懸液點入 24 孔板底部正中央，避免懸液接觸孔板側壁，每孔 30uL 左右。

注意：為防止基質膠室溫凝固，此步驟應盡快完成。

7. 將接種完成后的培養板至于 37℃二氧化碳恒溫培養箱中，孵育 15min 左右待基質膠凝固。

9. 配制肺腺癌類器官Complete medium培養基。

10. 待基質膠Complete medium凝固后，加入已配制好的人肺腺癌類器官Complete medium培養基，24 孔板每孔 500uL。

11. 將 24 孔板置于 37℃二氧化碳培養箱中培養，直到類器官需要進一步的實驗。