產(chǎn)品名稱：Magnetic Co-IP Kit，磁珠法Co-IP試劑盒

貨號： IF9058    

品牌：Engibody

CoIP試劑盒（磁珠法）在30分鐘內(nèi)快速免疫沉淀，以減少背景并提高瞬時蛋白質(zhì)復(fù)合物的捕獲，在洗滌劑、低pH緩沖液或普通質(zhì)譜溶劑存在下，蛋白質(zhì)A/G不會脫落。

試劑盒組分

Kit Contents:

Sufficient For: 40 Co-IP reactions, using 25 µL of magnetic beads slurry/reaction

• Protein A/G Magnetic Beads, 1 mL, Cat: IF0002, store at 4°C.

• Lysis Buffer for Co-IP, 50 mL, Cat: IF6603, store at 4°C

• Wash Buffer for Co-IP, 50 mL, Cat: IF9212, store at 4°C

• Elution Buffer, 4 mL, Cat: IF9213, store at 4°C

• Neutralization Buffer, 0.5 mL, Cat: IF9216, store at 4°C

• Sample Loading Buffer (Reducing and Denaturing, 5X), 1 mL, Cat: IF6740, store at -20°C

• Normal Rabbit IgG (Whole Molecule) Isotype Control,100 μL, Cat: AT1597, store at -20°C

• Normal Mouse IgG (Whole Molecule) Isotype Control,100 μL, Cat: AT1596, store at -20°C

試劑盒優(yōu)勢

1、Protein A/G磁珠確保與大多數(shù)一抗的良好的結(jié)合，無論是來自小鼠源抗體還是兔源抗體

2、在30分鐘內(nèi)快速免疫沉淀，以減少背景并提高瞬時蛋白質(zhì)復(fù)合物的捕獲

3、在洗滌劑、低pH緩沖液或普通質(zhì)譜溶劑存在下，蛋白質(zhì)A/G不會脫落

4、方便，全面的Co-IP試劑盒包含磁珠和完成免疫沉淀實驗的所有必要緩沖液

5、磁珠可以通過磁力架進行磁性分離，簡單高效，免去了常規(guī)離心步驟

6、現(xiàn)貨庫存，訂購秒發(fā)

磁珠法CoIP免疫共沉淀流程

A、 哺乳動物細胞裂解

方案一：貼壁細胞培養(yǎng)物的裂解

1.小心地從細胞中取出培養(yǎng)基。

2.用1X PBS洗滌細胞一次。

3.向細胞中加入用于CoIP的預(yù)冷裂解緩沖液（貨號：IF6603）。在冰上孵育10-20分鐘，定期混合。

注意：蛋白酶/磷酸酶抑制劑cocktail應(yīng)添加到裂解緩沖液中。蛋白酶抑制劑在水溶液中迅速失活，應(yīng)在使用前立即添加到溶液中。

表1.用于不同標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)板的CoIP裂解緩沖液的建議體積。

尺寸/表面積       CoIP裂解緩沖液體積

100 mm皿           500-1000μL

60 mm皿             250-500μL

4.將裂解物轉(zhuǎn)移到微離心管中，并在約13000×g轉(zhuǎn)速下離心。

5.將上清液轉(zhuǎn)移到新試管中，用于蛋白質(zhì)濃度測定和進一步分析。

注意：最佳裂解物濃度取決于目標(biāo)蛋白的表達水平。建議起始濃度為250μg/mL-1.0 mg/mL。

方案二：細胞懸浮培養(yǎng)物的裂解

1.以1000×g離心細胞懸浮液5分鐘，使細胞沉積。丟棄上清液。

2.通過將細胞懸浮在PBS中洗滌細胞一次。以1000×g離心5分鐘，使細胞沉積。

3.將冰冷的CoIP裂解緩沖液（貨號：IF6603）添加到細胞中。每50 mg細胞（即10:1 v/w）使用500μL用于CoIP的裂解緩沖液。如果使用大量細胞，首先向細胞中加入10%的最終體積的CoIP裂解緩沖液，并上下移液混合。將剩余體積的CoIP裂解緩沖液添加到細胞懸浮液中。

注意：蛋白酶/磷酸酶抑制劑cocktail應(yīng)添加到裂解緩沖液中。蛋白酶抑制劑在水溶液中迅速失活，應(yīng)在使用前立即添加到溶液中。

4.在冰上孵育裂解物5分鐘，并定期混合。以約13000×g離心10分鐘，去除細胞碎片。將上清液轉(zhuǎn)移到新的試管中進行蛋白質(zhì)濃度測定和進一步分析。

注意：最佳裂解物濃度取決于目標(biāo)蛋白的表達水平。建議起始濃度為250μg/mL-1.0 mg/mL。

B、 使用蛋白A/G磁珠預(yù)清除裂解產(chǎn)物（此步驟是可選的，預(yù)清除裂解物將減少蛋白質(zhì)與磁珠的非特異性結(jié)合。如果下游分析中出現(xiàn)高背景，則可以執(zhí)行此步驟。）

1.通過每1mL細胞裂解液添加20µL蛋白質(zhì)A/G磁珠漿液，并在4°C下在旋轉(zhuǎn)器上孵育10分鐘，預(yù)先清除細胞裂解液。

2.用24管磁分離架（貨號：IF9050）去除蛋白質(zhì)A/G磁珠。將上清液（細胞裂解液）轉(zhuǎn)移到冰上的潔凈離心管中。

注：在磁分離后的這一步驟中，應(yīng)丟棄蛋白質(zhì)A/G磁珠，應(yīng)保存上清液以備進一步的CoIP。

3.測定細胞裂解物的蛋白質(zhì)濃度（例如，如果進行Bradford測定，則在測定蛋白質(zhì)濃度之前必須將細胞裂解物稀釋至少1:10。

C、免疫共沉淀 CoIP

注：

•蛋白質(zhì)A/G磁珠（貨號：IF0002）應(yīng)在使用前充分懸浮。

•除非另有說明，否則在4°C下執(zhí)行所有Co-IP步驟。

•所需誘餌-獵物復(fù)合物的數(shù)量和孵育時間取決于所使用的系統(tǒng)以及抗體、誘餌和獵物相互作用的親和力，必須針對每個系統(tǒng)進行優(yōu)化。

1.將1 mL上述細胞裂解物或約1000µg總細胞蛋白轉(zhuǎn)移到1.5 mL微離心管中。添加推薦體積的一級抗體（最佳抗體濃度應(yīng)根據(jù)抗體數(shù)據(jù)表確定）和正常IgG（2.5µL），然后在旋轉(zhuǎn)器上在4°C下孵育2小時或過夜。

注：正常兔IgG（Cat:AT1597）是一種非特異性抗體，可作為兔一抗的同種型對照。正常小鼠IgG（Cat:AT1596）也是一種非特異性抗體，可作為小鼠一抗的同種型對照。

2.添加25µL-40µL再懸浮體積的蛋白質(zhì)A/G磁珠漿料，以捕獲誘餌-獵物免疫復(fù)合物。在搖臂平臺或旋轉(zhuǎn)裝置上在4°C下孵育1-2小時。

3.在4°C下用24管磁分離架（貨號：IF9050）收集免疫沉淀復(fù)合物。仔細抽吸并丟棄上清液。

4.用0.5 mL CoIP洗滌緩沖液（貨號：IF9212）洗滌復(fù)合物2-3次，每次洗滌持續(xù)5-10分鐘。每次清洗前，通過吸移管吸頭重新懸浮珠子復(fù)合顆粒。

提示：如果出現(xiàn)高背景，請將洗滌次數(shù)增加至5-6次。

D、 誘餌蛋白和獵物蛋白的洗脫和獲得

根據(jù)蛋白質(zhì)特性或進一步使用，推薦兩種方法：

選項A：用洗脫緩沖液洗脫（貨號：IF9213）。這是一種快速有效的洗脫方法。用中和緩沖液（Cat:IF9216）平衡洗脫的蛋白質(zhì)可能有助于保持其活性。

選項B：用樣品加載緩沖液（貨號：IF6740）煮沸，離心并獲得上清液，用于凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡。

選項A：用洗脫緩沖液洗脫（非變性洗脫）

該程序應(yīng)在室溫下進行。

注意：珠子在緩沖液中的停留時間不得超過20分鐘。

1.向每個樣品和對照珠復(fù)合物中添加100µL洗脫緩沖液，并通過移液器抽吸重新懸浮珠復(fù)合物顆粒。

2.在室溫下孵育樣品和對照5分鐘。

3.24管磁選架磁選。

4.將上清液轉(zhuǎn)移到新鮮試管中。小心不要轉(zhuǎn)移任何珠子。

5.為了平衡洗脫液，立即向每個樣品中添加10µL中和緩沖液。然后使用pH計確保pH值為7-8。

6.立即使用時，將洗脫的蛋白質(zhì)儲存在2-8°C。儲存在-20°C下，以便長期儲存。

選項B：用樣品加載緩沖液工作溶液煮沸，離心并獲得用于凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡的上清液。（變性洗脫）

該程序應(yīng)在室溫下進行。樣品加載緩沖液在使用前應(yīng)處于室溫。

1.制備樣品加載緩沖液工作溶液，向24µL裂解緩沖液中加入6µL 5×。

2.向每個樣品和對照珠復(fù)合物中添加30µL樣品加載緩沖液工作溶液，短暫渦旋混合，短暫微離心沉淀樣品

3.將樣品和對照煮沸10分鐘以使免疫復(fù)合物與珠分離。

4.使用磁選架的顆粒珠。上清液是樣品。將上清液轉(zhuǎn)移到新鮮試管中。樣品和對照準(zhǔn)備好進行SDS-PAGE和免疫印跡。