產品名稱：Co-IP 試劑盒

貨號： IF9055  

品牌：Engibody

對應關鍵詞：Co-IP Kit, Co-IP試劑盒，免疫共沉淀試劑盒（瓊脂糖珠法）

試劑盒描述

Co-Immunoprecipitation(Co-IP) Kit (Protein A/G Agarose Beads)

適用實驗

• Traditional Co-IP and downstream WB and MS

• Protein-protein interaction Co-IP for downstream analysis in nonreducing conditions, such as enzyme activity assay, protein structure research

試劑盒優勢

1、Protein A/G瓊脂糖珠確保與大多數一抗的良好的結合，無論是來自小鼠源抗體還是兔源抗體

2、在30分鐘內快速免疫沉淀，以減少背景并提高瞬時蛋白質復合物的捕獲

3、在洗滌劑、低pH緩沖液或普通質譜溶劑存在下，蛋白質A/G不會脫落

4、方便，全面的Co-IP試劑盒包含瓊脂糖珠和完成免疫沉淀實驗的所有必要緩沖液以及抗體的同型對照

5、現貨庫存，訂購秒發

試劑盒組分

Kit Contents:

Sufficient For: 40 Co-IP reactions, using 25 µL of beads slurry/reaction

• Protein A/G Agarose Beads, 1 mL, Cat: IF0001, store at 4°C

• Lysis Buffer for Co-IP, 50 mL, Cat: IF6603, store at 4°C

• Wash Buffer for Co-IP, 50 mL, Cat: IF9212, store at 4°C

• Elution Buffer, 4 mL, Cat: IF9213, store at 4°C

• Neutralization Buffer, 0.5 mL, Cat: IF9216, store at 4°C

• Sample Loading Buffer (Reducing and Denaturing, 5X), 1 mL, Cat: IF6740, store at -20°C

• Normal Rabbit IgG (Whole Molecule) Isotype Control,100 μL, Cat: AT1597, store at -20°C

• Normal Mouse IgG (Whole Molecule) Isotype Control,100 μL, Cat: AT1596, store at -20°C

CoIP流程

A、 哺乳動物細胞裂解

方案一：貼壁細胞培養物的裂解

1.小心地從細胞中取出培養基。

2.用1X PBS洗滌細胞一次。

3.向細胞中加入用于CoIP的預冷裂解緩沖液（貨號：IF6603）。在冰上孵育10-20分鐘，定期混合。

注：蛋白酶/磷酸酶抑制劑雞尾酒應添加到裂解緩沖液中。蛋白酶抑制劑在水溶液中迅速失活，應在使用前立即添加到溶液中。

表1.用于不同標準培養板的CoIP裂解緩沖液的建議體積。

尺寸/表面積    CoIP裂解緩沖液體積

100 mm皿         500-1000μL

60 mm皿           250-500μL

4.將裂解物轉移到微離心管中，并在約13000×。

5.將上清液轉移到新試管中，用于蛋白質濃度測定和進一步分析。

方案二：細胞懸浮培養物的裂解

1.以1000×g離心細胞懸浮液5分鐘，使細胞沉積。丟棄上清液。

2.通過將細胞懸浮在PBS中洗滌細胞一次。以1000×g離心5分鐘，使細胞沉積。

3.將預冷的CoIP裂解緩沖液（貨號：IF6603）添加到細胞中。每50 mg細胞（即10:1 v/w）使用500μL用于CoIP的裂解緩沖液。如果使用大量細胞，首先向細胞中加入10%的最終體積的CoIP裂解緩沖液，并上下移液混合。將剩余體積的CoIP裂解緩沖液添加到細胞懸浮液中。

注：蛋白酶/磷酸酶抑制劑cocktail應添加到裂解緩沖液中。蛋白酶抑制劑在水溶液中迅速失活，應在使用前立即添加到溶液中。

4.在冰上孵育裂解物5分鐘，并定期混合。以約13000×g離心10分鐘，去除細胞碎片。將上清液轉移到新的試管中進行蛋白質濃度測定和進一步分析。

B、 使用蛋白A/G瓊脂糖珠預清除裂解產物（此步驟是可選的，預清除裂解物將減少蛋白質與瓊脂糖珠子的非特異性結合。如果下游分析中出現高背景，則可以執行此步驟。）

1.通過向每1mL細胞裂解液中加入20µL蛋白質A/G瓊脂糖珠漿液，并在4°C下在旋轉器上孵育10分鐘，預先清除細胞裂解液。

2.通過在4°C下14000xg離心5分鐘，去除蛋白A/G瓊脂糖珠。將上清液（細胞裂解液）轉移到冰上的新鮮離心管中。

注：在離心后的這一步驟中，應丟棄蛋白A/G瓊脂糖珠，應保存上清液以備進一步的CoIP。

3.測定細胞裂解物的蛋白質濃度（例如，如果進行Bradford測定，則在測定蛋白質濃度之前必須將細胞裂解物稀釋至少1:10。

C、 CoIP

注：

•蛋白質A/G瓊脂糖珠（貨號：IF0001）應在使用前充分懸浮。

•除非另有說明，否則在4°C下執行所有Co-IP步驟。

•所需誘餌-獵物復合物的數量和孵育時間取決于所使用的體系以及抗體、誘餌蛋白和獵物蛋白相互作用的親和力，必須針對每個體系進行優化。

1.將1 mL上述細胞裂解物或約1000µg總細胞蛋白轉移到1.5 mL微離心管中。添加推薦體積的一級抗體（最佳抗體濃度應根據抗體數據表確定）和正常IgG（2.5µL），然后在旋轉器上在4°C下孵育2小時或過夜。

注：正常兔IgG（Cat:AT1597）是一種非特異性抗體，可作為兔一級抗體的同種型對照。正常小鼠IgG（Cat:AT1596）也是一種非特異性抗體，可作為小鼠一級抗體的同種型對照。

2.添加25µL-40µL再懸浮體積的蛋白A/G瓊脂糖珠漿，以捕獲誘餌-獵物免疫復合物。在搖臂平臺或旋轉裝置上在4°C下孵育1-2小時。

3.通過在4°C下以2500 rpm（約1000xg）離心5分鐘收集免疫沉淀復合物。仔細抽吸并丟棄上清液。

4.用0.5 mL CoIP洗滌緩沖液（貨號：IF9212）洗滌復合物2-3次，每次在溫和旋轉裝置上洗滌5-10分鐘，并重復上述離心步驟。

提示：如果出現高背景，請將洗滌次數增加至5-6次。

D、 誘餌蛋白和獵物蛋白的洗脫和獲得

根據蛋白質特性或進一步使用，推薦兩種方法：

選項A：用洗脫緩沖液洗脫（貨號：IF9213）。這是一種快速有效的洗脫方法。用中和緩沖液（Cat:IF9216）平衡洗脫的蛋白質可能有助于保持其活性。

選項B：用樣品加載緩沖液（貨號：IF6740）煮沸，離心并獲得上清液，用于凝膠電泳和蛋白質印跡。

選項A：用洗脫緩沖液洗脫（非變性洗脫）

該程序應在室溫下進行。

注：凝膠珠子在緩沖液中的停留時間不得超過20分鐘。

1.向每個樣品和對照珠子復合物中添加100µL洗脫緩沖液。

2.在室溫下輕輕搖晃樣品和對照5分鐘。

3.以8000×g離心珠子復合物60秒。

4.將上清液轉移到新鮮試管中。小心不要轉移任何珠子。

5.為了平衡洗脫液，立即向每個樣品中添加10µL中和緩沖液。然后使用pH計確保pH值為7-8。

6.立即使用時，將洗脫的蛋白質儲存在2-8°C。儲存在-20°C下，以便長期儲存。

選項B：用樣品loading buffer工作液煮沸，離心并獲得用于凝膠電泳和蛋白質印跡的上清液。（變性洗脫）

該程序應在室溫下進行。樣品加載緩沖液在使用前應處于室溫。

1.制備樣品加載緩沖液工作溶液，向24µL裂解緩沖液中加入6µL 5×。

2.向每個樣品和對照珠復合物中添加30µL樣品loading buffer工作液。

3.將樣品和對照煮沸10分鐘以使免疫復合物與珠子分離。

4.將樣品和對照品在8000×g離心60秒，以使任何未溶解的瓊脂糖珠粒沉淀。將上清液轉移到新鮮試管中。樣品和對照準備好進行SDS-PAGE和免疫印跡。