免疫細胞化學ICC實驗服務

免疫細胞化學是將免疫學基本原理與細胞化學技術相結合所建立起來的新技術,根據(jù)抗原與抗體特異性結合的特點，檢測細胞內(nèi)某種多肽、蛋白質(zhì)及膜表面抗原和受體等大分子物質(zhì)的存在與分布。

一、 免疫細胞化學技術的概述

免疫細胞化學(immunocytochemistry, ICC)一是利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑(熒光素、酶、屬離子同位素)顯色來確定細胞內(nèi)抗原的成分(主要是多肽和蛋白質(zhì)),對其進行定位、定性及定量的研究，稱為~。

(一)免疫細胞化學對抗原和抗體的要求

1)具有特異性高和親和力強的抗體是實驗成功的首要條件。

對抗體的要求: 純度高、比活性強;

2) 高度特異性抗體的獲得，取決于抗原的純度。

對抗原的要求:純度高，免疫原性強，穩(wěn)定無變化。

(二)免疫細胞化學抗原(antigen, Ag)

1)抗原的概念:凡是在機體內(nèi)引起體液兔疫和(或)細胞免疫反應的物質(zhì)，稱為抗原。抗原具有兩個方面的

特性:

①免疫原性:引起機體產(chǎn)生抗體和(或)致敏淋細胞的特性;

②免疫反應性:抗原能與相應的抗體及致敏淋巴細胞發(fā)生特異的結合或反應的特性。

2)根據(jù)抗原是否顯示免疫原性分為:

①*抗原:分子量較大，-般在10kDa以上,并具有較復雜的化學組成。免疫原性zui強的是蛋白質(zhì)抗原，多糖次之;脂類和核酸必需和蛋白質(zhì)及多糖形成復合物才具有良好的免疫原性。

②半抗原:又稱為不*抗原，分子量較小。例如:某些短肽、多糖、類脂和藥物等。半抗原必需與載體結合，才能獲得免疫原性。

免疫細胞化學載體

通常是具有高度免疫原性的大分子物質(zhì)，具有將免疫原性傳遞給耦聯(lián)的半抗原能力。

①常用的載體有鑰孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)、 牛血清白蛋白(bovine serumalbumin, BSA).卵白蛋白(Ovalbumin, OVA)等。

②戊二醛或碳化二亞胺作為交聯(lián)劑通過功能基團-NH2、-COOH等將半抗原結合到載體上。結合比例為5kDa結合5 ~ 25個分子的小肽。

(三)抗體(antibody, Ab)

1.抗體的概念:

①機體受到抗原刺激后，由漿細胞合成并分泌出一類具有與抗原發(fā)生特異性結合的球蛋白，被稱為抗體。

②抗體主要存在于血清內(nèi);

③抗體都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不-定都是抗體。

④免疫球蛋白根據(jù)重鏈的結構及抗原特異性不同分為五種，既lgG、lgD、 lgE、 lgA. IgM.

2、兔疫組化實驗中常用的抗體:單克隆抗體和多克隆抗體。

①單克隆抗體:是一個B淋巴細胞克隆分泌的抗體，是應用細胞融合雜交瘤技術免疫動物制備的。特異性強、抗體產(chǎn)量高。

②多克隆抗體:是將純化后的抗原直接免疫動物后，從動物血中所獲得的免疫血清，是多個B淋巴細胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。

-特異性低，會產(chǎn)生抗體的交叉反應。

-多克隆抗體廣泛應用于石蠟包埋組織切片，可減少假陰性染色機會。

-抗原與抗體的結合，要求量保持一定比例， 當抗原或抗體過量時，是不能聚合成大顆粒。

3、抗體的制備一多克隆抗體的制備

①動物的選擇

②佐劑(adjuvant)

③免疫方法

④免疫劑量

⑤抗體效價的測定

⑥放血或定期抽血

選擇什么動物來免疫取決于:

(1)動物的選擇

①所需抗血清的量

小鼠只能提供1.0 ~ 1.5ml的血液，而山羊能提供幾升。

②能供免疫用的抗原量小鼠50mg足夠，而山羊需要幾毫克。

③動物的品系:免疫動物與提供抗原的動物之間的種系差異越大越好。

例如哺乳動物的抗原可選擇非哺乳動物來制備抗體。

常用的動物有兔、羊、馬、豬等,以兔(新西蘭兔，年輕，健壯,體重在2 .5kg左右,雄性)為zui常用。