0827775 干細胞 類器官用基質膠推薦的應用：

干細胞培養，如hESC,iPSC,提供人胚胎干細胞和誘導多功能性干細胞無滋養層培養所需的可重復性和一致性。

產品貨號：0827775

中文名稱：ABW基質膠  干細胞

產品規格：5ml

產品品牌：ABW

0827775 干細胞 類器官用基質膠可運用領域：

1.類器官培養  2.血管生成實驗  3.細胞侵襲實驗，Transwell實驗    4.PDX，CDX模型實驗  5.愿為腫瘤移植，皮下成瘤實驗  6.干細胞培養及細胞分化研究  7.其他待開發實驗類型

ABW® 誘導多能干細胞培養方案

ABW® Induced Pluripotent Stem Cell（iPSC）Culture Protocols

一、培養材料

1、試劑：ABW® Matrigengel（REF: 0827775）；ROCK 抑制劑（Y-27632）；DMEM F12/DMEM；mTeSR1/E8培養基；Accutase解離劑、PBS(D-PBS）

2、耗材：無菌槍頭；六孔板；無菌EP管。

二、培養準備

1、材料預冷：

a、將ABW® Matrigengel 置于冰盒中，放入 4℃冰箱，使膠能過夜緩慢融化;

b、4℃預冷無菌離心管、無菌槍頭、六孔板、DMEM F12/DMEM；

2、將ABW® Matrigengel（REF: 0827775）以1：80或1：100比例進行稀釋：

a、將適量4℃的DMEM F12/DMEM移入冷卻的15/50 mL EP中;

b、使用移液器將預冷的槍頭從EP管吸取DMEM F12/DMEM中移入分裝好的ABW® Matrigengel，再吸取轉移至EP管內；重復幾次，直到基質膠*移入到EP管中。

c、按比例混合后作為儲備基質膠混合液，進行后續鋪板；

3、制作基質膠涂層

a、按1mL/孔將基質膠混合液加入預冷的六孔板中，輕輕晃動以確保混合液均勻鋪在板上；

b、將6孔板轉移到37℃孵育過夜（板材可以在孵育一小時后即可使用，但過夜孵育的涂層對細胞培養效果更佳）；

c.使用前吸去涂層上方液體。

4、配置ROCK 抑制劑（Y-27632）工作液：使用無菌PBS將Y-27632溶解，配置成10mM溶液（1000X），工作濃度為10μM;

5、配置含ROCK抑制劑mTeSR1/E8培養基：將10mM溶液加入mTeSR1/E8培養基至終濃度為10μM。

注意：ABW® Matrigengel在>4℃時會逐漸聚合成膠，請嚴格把控操作溫度，控制操作時間；稀釋后的基質膠混合液同樣需要冰上操作。

一、細胞培養

1、復蘇iPSC

a.從液氮罐或干冰中取出ipsc，37℃水域中解凍，解凍應迅速完成；

b.用75% 酒精消毒凍存管后轉移到超凈臺/生物安全柜；

c.將細胞溶液轉移到新的15ml EP管中，用DMEM F12/DMEM沖洗凍存管兩次

d.室溫 300g 離心5min（ipsc對于200-300g的轉速都有較好的耐受性，建議使用300g來最.大限度捕捉細胞，標準程序下建議使用200g）;

e.棄上清，用2mL含有ROCK抑制劑的培養基輕柔地重懸iPSC后轉移到用鋪好板的孔中，前后搖動使得細胞均勻分布（建議將每瓶細胞1*10 6裝在六孔板的一個孔內使細胞存活率最D化）

f.將六孔板放回37℃培養箱，（請在細胞被轉移后立即執行，避免細胞中.央密度增加）

g.次日撤去ROCK抑制劑，即用無抑制劑的培養基替代含抑制劑的培養基培養細胞。

注意：細胞培養過程中不提倡使用抗生素，其會干擾細胞和其分化潛能；培養環境應與其他細胞隔離，兩次傳代后檢測支原體；DMSO在室溫下對細胞有毒，復蘇步驟應快速完成

2、iPSC傳代

a.將培養上清吸去，用1mL的PBS清洗后加入1mL Acuutase；

b.轉移到37℃培養箱3分鐘，或在顯微鏡下觀察直到大部分細胞脫落（若細胞仍然附著，可將培養板放在手上，另一手輕輕在你的手上拍打使板發生輕微震動從而使細胞脫落）；

c.傳代前準備好基質膠涂布的六孔板

d.傾斜培養板，將Accutase溶液沿培養層表面轉移兩次，分離結塊并轉移到離心管中

e.用DMEM F12/DMEM沖洗培養層表面，并與管中的細胞溶液合并（使用DMEM/F12或用PBS洗滌，建議使用至少5%的培養基，有利于隨后的造粒和附著）；

f.室溫下 300g 離心五分鐘

g.吸去上清，用含有ROCK抑制劑的培養基進行重懸；

h.將細胞加入到涂層板中，輕輕搖動使細胞分布均勻；

i.將培養板放入37℃培養箱中孵育。

注意：IPSC生長為單層后則會迅速分化并死亡，為了保持生長和多能性，需在其長滿前進行傳代。

3、iPSC細胞凍存

a.準備細胞和解離液，在解離液解離細胞過程中，將培養基與10%DMSO混合，在凍存管上貼好標簽，配置好凍存液（可選20%血清或血清替代物提高存活率， 也可以使用90%胎牛血清+10%DMSO）；

b.分離細胞方法同傳代，可以使用細胞計數器來配合進行細胞的凍存；

c. 以1X10^6 凍存每管細胞，之后進行離心、抽吸培養基，然后在適當體積的凍存液中進行重懸；

d.將1ml重懸好的細胞凍存液加到1.5ml凍存管中，并進行程序性降溫，在液氮罐中長期保存。