原代細胞切割，取材儀 生物工程

功能特點

原代細胞切割，取材儀 

適用于切割臍帶、胎盤、皮膚等軟性組織；

切割均勻，易于爬出和培養；

大幅減少人工剪切時間和降低工作勞累；

即插即用，采用拋棄型耗材，避免重復污染；

電動型，適合用于在生物安全柜里無菌操作

可個性化定制

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由于細胞異質性的存在，單細胞層面的分析就變得十分重要。目前對于單細胞分析的方法主要還是通過化學、生物學的方法進行裂解后，提取內容物進行分析，然而這種方法往往會對樣本造成一些損傷。直接提取活細胞具有諸多優點，但是操作苦難。如今一種全新使用FluidFM科技的技術新報道有望提供一種活細胞提取新型的簡易方法。

1.為什么要進行活體單細胞提取

隨著技術的發展，對于細胞的研究開始向單細胞領域的分析靠攏。隨著細胞異質性的發現以來，人們開始更多地認識到即使基因型*相同，但由于基因表達的不同，也會導致細胞的表型出現差異，從而使得每個細胞的功能、組成等各方面也不*相同。而這種差異是在生物界廣泛存在的，即使同源細胞群中也是存在的。因此對于單細胞層面的分子分析，成為了揭示病理特征，細胞應激等方面的重要手段。

在目前的單細胞分析手段中也面臨著諸多挑戰。目前主要的方法是使用流式細胞儀或者微流控芯片對細胞進行分選并隔離單細胞，然后通過裂解的方式對細胞進行分析。這種高通量分選的方式雖然快速，但是本身需要將細胞從原始的培養環境中取出，這樣始終會導致細胞內部一些生物信息的丟失或損傷。而且由于細胞破壞方式使用的是化學或者生物手段裂解，所使用的裂解液也會對細胞之中的一些組分產生破壞。因此單細胞分析始終面臨著重大的挑戰。

因此，學者開始嘗試從活細胞中直接提取其成分。目前已經有諸多不同的活細胞提取技術得到了建立，并且通過這類的方法所提取分析內容的方法所獲得的結果往往要好于裂解的方式。因此活細胞提取技術是一種更加無損的獲得細胞內組分的方式。

2.使用FluidFM設備提取細胞并不會影響細胞活力

在本文中，作者對首先建立了一種使用FluidFM提取細胞的方法。他們嘗試了各種提取量以確定使用FluidFM能夠對細胞提取的大量。在實驗中他們發現使用FluidFM抽取4 pL的細胞質并觀測，發現82%的細胞依然存活，如圖1B所示。但是如果將抽取量加大到4.5 pL則無細胞能夠存活。而對細胞核而言抽取0.6 pL后，有86%的細胞依舊存活，如圖1A。而在0.7 pL或以上的體積提取則不可避免的導致細胞死亡，如圖1B所示。隨后他們對提取后細胞的存活狀況進行了考察。而后他們繼續對提取過的細胞進行觀察，結果發現這些細胞的功能并沒有受到影響。細胞能夠在提取后約30小時后正常分裂，如圖1E所示。因此作者認為使用FluidFM提取的大量為細胞核0.6 pL和細胞質4pL。

3.使用FluidFM單細胞提取物的三種應用

3.1透射電鏡負染色觀測

對于細胞亞結構的觀察，往往對于揭示細胞病變有著重要的意義。然而細胞裂解的傳統手段往往會產生大量的碎片，因此對細胞器的觀察造成了諸多困難。在本篇報道中，作者通過使用FluidFM設備提取細胞內容物，在低溫環境下轉移到透射電鏡的銅網上，然后進行負染色和揮干，之后將片子放到透射電鏡下觀察，并使用傳統裂解方法得到單細胞溶液同時鋪設在銅網上進行對比。通過觀察他們發現，使用FluidFM技術得到的細胞提取物能夠觀察到大泡狀的結構、小球狀的結構和長絲類的結構，如圖2C所示。而相比之下細胞裂解法得到的結果卻不盡人意，如圖2D所示。

3.2酶活力的檢測

酶活力的檢測對于探尋細胞異質性有著十分重要的意義。因此作者也對FluidFM提取的細胞提取物進行了對比。首先作者通過β-半乳糖苷酶實驗來測定提取蛋白的完整性。通過測定酶解底物產生的熒光素的熒光強度，他們成功觀察到熒光強度隨時間而增加，說明提取物中的蛋白沒有被破壞，如圖3C、D所示。隨后作者又對不同細胞進行了不同酶活力的檢驗，結果顯示無論是LacZ轉基因HeLa細胞上還是在測定HeLa細胞的Caspase3酶上均取得了成功，如圖3 E、F所示。

4.3單細胞級轉錄檢測

單細胞層面的基因表達通常需要反轉錄或者PCR擴增，之后使用qPCR測定。而在此之前往往需要將細胞裂解，而作者他們采用了與傳統方法不同的策略。他們首先創建了使用FluidFM直接從活細胞中提取大約0.01 pg RNA，并用普通PCR管合成cDNA并進行qPCR檢測，如圖4A所示。由于如此小的提取量是不能直接放到PCR管里面的，所以他們采取的策略是首先將提取液注入1uL水中，然后再轉移到PCR管中，進行合成和檢測如圖6B所示。他們檢測了兩種管家基因beta-actin (ACTB)beta-2-microglobulin (B2M)以及GFP mRNA的表達量。在21個樣本中有90%的樣本成功檢測到至少1中基因的表達，其中2/3的樣本可以同時檢測到三種基因的表達。而對細胞核的檢測中，也能夠檢測到至少一種基因的表達，如圖4C所示。在對比同一細胞同時提取細胞質（1.7 pL）和細胞核（1.3 pL）中這三種基因的表達時，可以發現兩者基本相同，如圖4D所示。

總結

隨著生物研究越發趨于微觀化，對于分析單個細胞的需求變得越來越大。但是由于單個細胞體積小，所能夠提取出的物質相比以前細胞群落分析來說，難度顯著提高。這不僅對檢測儀器的靈敏度有了新的更高的要求，也同時對樣本本身的質量也提出了更高的指標。本篇中使用FluidFM提取活細胞所取得的樣本質量相比于傳統裂解手段有了明顯的提高，從而取得了令人滿意的結果。另外這種方法控制提取量后，甚至能夠做到不殺死細胞的情況下完成提取，這使得對于對單個細胞代謝測定的追蹤成為了可能。