免疫印跡Western Blot 代做免疫印跡（Western Blot）實驗
| 參考價 | ￥ 150 |
| 訂貨量 | ≥1 |
具體成交價以合同協議為準
- 公司名稱 上海維景生物科技有限公司
- 品牌
- 型號 免疫印跡Western Blot
- 產地 上海
- 廠商性質 代理商
- 更新時間 2023/6/15 11:02:19
- 訪問次數 2141
產品標簽
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代做Western Blot實驗，代做免疫印跡實驗
Western Blot標準protocol
成功完成Western Blot檢測，必須滿足4個條件：
- 凝膠洗脫：轉移期間蛋白質必須從凝膠中洗脫出來，如果蛋白質還截留在凝膠中，將無法在膜上進行分析
- 吸附到膜上：在轉移過程中蛋白質必須吸附到膜上，如果蛋白不吸附，將無法在膜上進行分析
- 處理期間仍截留在膜上：在轉移后的處理過程中蛋白質必須保持吸附在印跡膜上
- 處理過程中可接近：被吸附的蛋白質必須能夠與檢測試劑接觸，如果蛋白質被掩蓋則無法檢測
成功進行WB檢測，則設置合適正確的對照是*的，只要正確設置了這些對照，即可快速和準確的找到WB的問題所在，并保證實驗結果的準確性和特異性！一般需要設置的對照如下：
- 陽性對照：明確表達檢測蛋白的組織或細胞，用于檢測抗體的工作效率
- 陰性對照：明確不表達檢測蛋白組織或細胞，用于檢測抗體的特異性
- 二抗對照：不加一抗，用于檢測二抗的特異性
- 內參對照：檢測標本的質量和二抗系統
- 空白對照：不加一抗和二抗；用于檢測膜的性質和封閉的效果
WB檢測基本過程
1、獲取細胞或組織裂解物
1）根據檢測蛋白的位置選擇合適的裂解buffer：
| 蛋白位置 | *buffer |
| 全細胞 | NP-40 or RIPA |
| 胞漿（可溶性蛋白） | Tris-HCl |
| 胞漿（骨架結合蛋白） | Tris-Triton |
| 膜蛋白 | NP-40 or RIPA |
| 核蛋白 | RIPA or 核蛋白提取試劑盒 |
| 線粒體蛋白 | RIPA or 線粒體分離試劑盒 |
亦可購買商業化的蛋白提取試劑盒來保證標本制備的質量
2）選擇合適的蛋白酶抑制劑，避免蛋白降解，從而保證檢測的準確性！
2、蛋白定量
常用的蛋白定量方法：Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后，可根據情況將標本保存在-20°C /-80°C備用，進行免疫沉淀（IP）或者直接進行電泳分離蛋白
3、電泳分離蛋白質
根據待測蛋白狀態確定電泳條件：
| 待測蛋白狀態 | 凝膠條件 | 上樣buffer | 電泳buffer |
| Reduced - Denatured | 還原，變性 | 含β-巰基乙醇或DTT，含SDS | 含SDS |
| Reduced - Native | 還原，不變性 | 含β-巰基乙醇或DTT，不含SDS | 不含SDS |
| Oxidized - Denatured | 不還原，變性 | 不含β-巰基乙醇或DTT，含SDS | 含SDS |
| Oxidized - Native | 不還原，不變性 | 不含β-巰基乙醇或DTT，不含SDS | 不含SDS |
根據待測蛋白分子量大小確定凝膠濃度
| 蛋白分子量（kDa） | 凝膠濃度（％） |
| 4-40 | 20 |
| 12-45 | 15 |
| 10-70 | 12.5 |
| 15-100 | 10 |
| 25-200 | 8 |
4、轉膜
根據不同的檢測目的和待測蛋白的特性，選擇合適的膜類型。常用的轉移膜類型有：PVDF膜、硝酸纖維素膜（NC膜）和尼龍膜，其中PVDF和NC膜的使用頻率zui高。各種膜的技術參數及比較如下：
| | PVDF膜 | NC膜 | 尼龍膜 |
| 靈敏度和分辨率 | 高 | 高 | 高 |
| 背景 | 低 | 低 | 較高 |
| 蛋白結合能力 | 100-200ug/cm2（適用于SDS存在時與蛋白結合） | 80-100ug/cm2 | >400ug/cm2 |
| 機械強度 | 強 | 干的膜易脆 | 軟而結實 |
| 溶劑抗性 | 強 | 差 | 差 |
| 使用前是否需要浸潤 | *甲醛潤濕 | 緩沖液潤濕 | 緩沖液潤濕 |
| 適用染色方法 | 膠體金、麗春紅、酰胺黑、印度墨汁、考馬斯亮蘭 | 膠體金、麗春紅、酰胺黑、印度墨汁 | 不能用陰離子染料 |
| 適用檢測方法 | 顯色法、化學發光、熒光、放射性、化學熒光、快速免疫檢測 | 顯色法、化學發光、熒光、放射性 | 顯色、化學發光、放射性 |
| 適用范圍 | 普通蛋白WB、糖蛋白檢測、蛋白質測序、氨基酸分析、重復檢測 | 普通蛋白WB、氨基酸分析、重復檢測。0.1um膜適用于7kDa以下蛋白 | 低濃度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸檢測常用 |
| 價格 | 高 | 較低 | 低 |
5、封閉
去掉膜上多余的非特異性結合位點，降低背景。常用的封閉溶液有：含BSA或者脫脂奶粉的TBST或TBS
6、一抗孵育
一抗的選擇成功與否，是整個WB實驗成功的關鍵：選擇一抗有以下幾個注意點：
- 選擇適合檢測標本種屬的一抗（說明書有驗證）
- 選擇適用于WB實驗方法的一抗（說明書有驗證）
- 選擇單克隆抗體或者經過親和純化的多克隆抗體
一抗的保存和使用：
- 根據說明書的要求條件進行抗體的保存；一般需要將抗體分裝后放入-20度保存，避免反復凍融。
- 抗體的工作液現配現用，在4度保存不要超過2周
- 根據說明書*濃度使用TBST稀釋一抗。由于實驗室條件和檢測方法等的差異，說明書*的稀釋比例只作參考，需要在說明書*的濃度周邊進行多個濃度梯度的實驗檢測，然后選擇信噪比的抗體濃度進行實驗。如果說明書沒有*濃度，可進行多個稀釋比例進行摸索*稀釋度（1:100-1:3000）。
- 孵育條件：*4°C孵育過夜（一般大于18個小時），根據抗體親和力不同孵育時間有所區別
內參的選擇和使用：WB過程監測以及目的蛋白定量的標準！
WB常用內參及其技術參數：
| 內參名稱 | 分子量大小 | 適用范圍 |
| beta-actin | 43kDa | 胞漿和全細胞 |
| GAPDH | 30-40kDa | 胞漿和全細胞 |
| Tubulin | 55kDa | 胞漿和全細胞 |
| VCDA1/Porin | 31kDa | 線粒體 |
| COXIV | 16kDa | 線粒體 |
| TBP | 38kDa | 細胞核 |
7、二抗孵育
根據說明書*濃度使用TBST稀釋一抗。如果說明書沒有*濃度，可進行多個稀釋比例進行摸索*稀釋度（1:1000-1:20000）。孵育條件一般為室溫1-2小時
8、底物孵育
選擇顯色或者化學發光底物。一般傾向于化學發光，靈敏度高且背景低，節省抗體用量
9、結果分析和檢測
凝膠成像系統檢測或者暗室曝光到膠片
Note：從封閉開始，每步之間都需要用TBST進行洗滌，3次，每次5min
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上海維景生物科技有限公司憑借優質的技術服務平臺和專業的技術服務團隊，維景生物傾情打造zui高質量的技術服務。至今，已為廣大科研客戶和合作伙伴提供了實時定量 PCR、細胞凋亡、 Western-blot 、 Elisa 、免疫組化、原位雜交、質粒載體的構建、穩定細胞系的篩選、 siRNA干擾效率的鑒定、雙螢光報告系統、蛋白表達及純化、腺病毒 / 腺相關病毒 / 慢病毒的包裝服務、單多克隆抗體的制備、 SCI文章的修改及發表服務等。
生物實驗技術服務項目列表
預實驗免費！常用抗體免費！
分子克隆技術服務：載體構建、定點突變、RT-PCR、熒光定量PCR、SNP分型等；
蛋白免疫學實驗服務：Western Blot檢測、免疫組化檢測、流式檢測與分選，細胞凋亡檢測與分析、抗體制備等。
細胞生物學技術服務：細胞培養、原代培養、細胞株構建、三維培養、病毒包裝（慢病毒、逆轉錄和腺病毒）、細胞分選與培養、細胞侵襲與催化、共聚焦檢測等技術
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